小脳プルキンエ細胞におけるシナプス伝達の長期抑圧の分子機構の解析

小脑浦肯野细胞突触传递长期抑制的分子机制分析

• 批准号: 11170213
• 负责人: 道川 貴章
• 金额: $ 4.48万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 2000
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11170213/
• 关键词: シナプス可塑性; プルキンエ細胞; 長期抑圧; カルシウム; セカンドメッセンジャー; カルモジュリン; イノシトール3リン酸受容体

これまで当研究室では、小脳プルキンエ細胞と顆粒細胞の軸索である平行線維間のシナプス伝達の長期抑圧(LTD)において、細胞内Ca^<2+>放出チャネルであるイノシトール3リン酸受容体(IP_3R)によるCa^<2+>放出がLTDの誘導に必須であることを明らかにしてきた。本研究課題では、プルキンエ細胞におけるCa^<2+>動態形成の分子機構を解析するために、細胞質Ca^<2+>によるIP_3Rの正および負のフィードバック調節という二相性の活性制御に着目し、その分子機構を解析した。精製IP_3RのCa^<2+>依存性を調べることにより、低濃度Ca^<2+>による活性化はIP_3RにCa^<2+>が直接作用することにより引き起こされ、これに対し高濃度Ca^<2+>による抑制にはカルモジュリンが関与していることを明らかとした。その結果、カルモジュリンは平行線維刺激によるプルキンエ細胞内Ca^<2+>上昇を、特に細胞内貯蔵器官からのCa^<2+>放出を抑制することでシナプス入力部位に限局させ、LTDの入力特異性に寄与していることが示唆された。さらに、IP_3RのCa^<2+>感受性を人為的に操作することで引き起こされるプルキンエ細胞内のCa^<2+>動態の変化およびLTD誘導における効果を調べることを目的とし、Ca^<2+>感受性の異なるIP_3Rの作成を試みた。但し、IP_3Rはほとんどすべての細胞に発現していることから、これまで人為的に発現させたIP_3RのみによるCa^<2+>放出活性を測定することが困難であった。そこで本研究では、これまでに知られている3種類のIP_3Rサブタイプすべてに対して遺伝子ノックアウトを施した細胞に変異IP_3Rを導入する系を構築し、この実験系を用いることで外来性に発現させたIP_3Rの解析が可能であることを明らかにした。今後、この実験系により作成した変異受容体を用いることで、プルキンエ細胞樹状突起でのCa^<2+>動態の形成機構が明らかになることが期待される。

我们实验室先前报道，肌醇三磷酸受体是细胞内Ca^2+释放通道，参与平行纤维之间突触传递的长期抑制（LTD），平行纤维是小脑浦肯野细胞和颗粒细胞的轴突我们已经表明，(IP_3R) 释放的 Ca^<2+> 对于 LTD 的诱导至关重要。在本研究项目中，为了分析浦肯野细胞中Ca^<2+>动态形成的分子机制，我们重点关注细胞质Ca^<2+>的正反馈和负反馈调节对IP_3R的双相活性控制。并分析了其分子机制。通过考察纯化IP_3R的Ca^<2+>依赖性，我们发现低浓度Ca^<2+>的激活是由Ca^<2+>对IP_3R的直接作用引起的，而高浓度Ca^<2+>的激活是由Ca^<2+>对IP_3R的直接作用引起的。 IP_3R 已揭示钙调蛋白参与Ca 2+ 的抑制。结果，钙调蛋白通过特异性抑制细胞内储存器官的Ca^2+释放，将平行纤维刺激引起的浦肯野细胞内Ca^2+的增加局部化，从而引起LTD输入。有人认为这有助于提高特异性。此外，我们的目的是研究浦肯野细胞内Ca^<2+>动力学的变化以及人为操纵IP_3R的Ca^<2+>敏感性对LTD诱导的影响+>我们尝试创建具有不同敏感性的IP_3R。然而，由于IP_3R几乎在所有细胞中表达，因此仅通过人工表达的IP_3R很难测量Ca ^ 2+ 释放活性。因此，在本研究中，我们构建了一个系统，将突变型IP_3R引入到对所有三种已知IP_3R亚型进行基因敲除的细胞中，并且使用该实验系统，我们可以表达IP_3R的外源表达。可以分析IP_3R。未来，预计通过使用该实验系统创建的突变受体，我们将能够阐明浦肯野细胞树突中Ca^2+动力学的形成机制。

项目成果

Yoshikawa, F.: "Cooperative formation of the ligand binding site of the IP3 receptor by two separable domains"J. Biol. Chem.. 274. 328-334 (1999)

Yoshikawa, F.：“两个可分离结构域协同形成 IP3 受体的配体结合位点”J.

Hirota, J.: "Calmodulin inhibits inositol 1,4,5-triphosphate-induced calcium release through the purified and reconstituted inositol 1,4,5-triphosphate receptor type1"FEBS lett.. 456. 322-326 (1999)

Hirota, J.：“钙调蛋白通过纯化和重构的肌醇 1,4,5-三磷酸受体 1 型抑制肌醇 1,4,5-三磷酸诱导的钙释放”FEBS lett.. 456. 322-326 (1999)

Yoshikawa, F.: "Trypsinized cerebellar IP3 receptor : Structure and functional coupling of cleaved ligand binding and channel domains"J. Biol. Chem.. 274. 316-327 (1999)

Yoshikawa, F.：“胰蛋白酶化的小脑 IP3 受体：裂解的配体结合和通道域的结构和功能耦合”J。

Michikawa,T.: "Feedback regulation of the inositol 1,4,5-trisphosphate receptor/Ca^ release channel by Ca^"Control and Diseases of Sodium Dependent Transport Proteins and Ion Channels. 217-220 (2000)

Michikawa,T.：“Ca^2 对肌醇 1,4,5-三磷酸受体/Ca^2 释放通道的反馈调节”钠依赖性转运蛋白和离子通道的控制和疾病。

Michikawa, T.: "Calmodulin mediates calcium-dependent inactivation of cerebellar type 1 inositol 1,4,5-trisphosphate receptor"Neuron. 23. 799-808 (1999)

Michikawa, T.：“钙调蛋白介导小脑 1 型肌醇 1,4,5-三磷酸受体的钙依赖性失活”神经元。