小胞輸送系を介した細胞の運命決定機構

囊泡运输系统介导的细胞命运决定机制

• 批准号: 08J02057
• 负责人: 白川 一
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2008
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2008 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08J02057/
• 关键词: 細胞内輸送; 維管束; ミロシン細胞; SNARE; シロイヌナズナ; 液胞輸送系

小胞輸送系を介した細胞の運命決定機構を解析するために,採用者は植物のSNARE複合体と維管束細胞及びミロシン細胞に着目して,研究を遂行した.1).SNARE複合体を介した細胞の運命決定機構の解析-採用者は,液胞型SNAREであるVAM3とVTI11の変異体を用いて維管束の未熟な発達の分子機構を解析した.解析により,液胞型SNARE複合体はオーキシン排出キャリアーであるPIN1の極性を持った細胞内局在を制御していることを明らかにした.PIN1の細胞内極性が失われることにより,オーキシンの組織分布が変化し,結果的に維管束前駆細胞の運命決定が正確に行われないことを明らかにした.本研究をまとめ,学会誌に発表した.採用者は,液胞型SNAREであるVAM3とVTI11の変異体において,維管束周辺に分布するミロシン細胞の数は多くなることを見出していた.ミロシン細胞を蛍光タンパク質で可視化する系を確立し,変異体では葉の発生初期においてミロシン細胞の運命決定が亢進していることを明らかにし、かつミロシン細胞は維管束前駆細胞とは独立に分化してくることも明らかにした.Rab5 GEFの変異体においても液胞型SNARE変異体と同様に,維管束の未熟な発達・ミロシン細胞の分化亢進が観察されることを明らかにした.小胞輸送系の中でも特定の経路に依存した,細胞の運命決定機構が明らかとなった.2).VAM3ホモログによる冗長的な維管束細胞とミロシン細胞の運命決定機構の解析-液胞型SNAREであるVAM3には,PEP12とSYP23の2つのホモログが存在する.細胞内で,VAM3は液胞膜に,PEP12は液胞前区画膜に存在することが明らかにされている.SYP23は膜貫通領域を持たないことから,細胞質に局在し,機能的なSNAREではないと考えられている.採用者は,細胞内で異なる局在性を示すVAM3,PEP12,SYP23が冗長的に,もしくは特異的に維管束細胞とミロシン細胞の運命決定に関与しているかを解析した.採用者は,VAM3,PEP12,SYP23の単独変異体,二重変異体,及び三重変異体をTDNA挿入変異体及び人工microRNAを用いて作製した.VAM3,PEP12の二重変異体は発生初期の致死性を示した。変異体における植物の成長(背丈)・ミロシン細胞の分化亢進・維管束の発達・12Sグロブリンの液胞への輸送を解析した.すべての形質において,VAM3,PEP12,SYP23は冗長的に働いていることを明らかにした.この結果から,機能不全のSNAREであると考えられていたSYP23に機能があることがわかったので,SYP23の細胞内局在とSNARE複合体形成能を解析した.GFP融合SYP23遺伝子を作製し,植物体に導入後,蛍光顕微鏡により,SYP23は細胞質に局在していることを明らかにし、GFP-SYP23発現植物体を用いた免疫沈降実験により,SYP23はVTI11・SYP5のSNAREタンパク質と結合することがわかった.以上の結果から,まったく異なる細胞内局在を示すSNAREタンパク質が,細胞の運命決定機構に関与することが明らかとなった.本研究成果を学会で発表した.

为了分析囊泡运输系统介导的细胞命运决定机制，申请人针对植物SNARE复合物、维管细胞和黑芥子细胞进行了研究1)通过液泡SNARE VAM3和V进行细胞命运决定机制。利用突变体 TI11，我们分析了维管束过早发育的分子机制。分析表明，液泡 SNARE 复合体控制着生长素外流载体 PIN1 的极化细胞内定位，我们发现 PIN1 的细胞内极性丧失导致了激活 PIN1。结果表明，Xin的组织分布发生了变化，导致血管前体细胞的命运测定无法准确进行。该研究进行了总结并发表在学术期刊上。在某些VAM3和VTI11突变体中，myrosin的数量发生了变化。维管束周围分布的细胞较多。我们建立了一个使用荧光蛋白可视化黑芥子细胞的系统，发现黑芥子细胞命运决定在叶片发育早期的突变体中得到增强，并且黑芥子细胞是血管前体细胞，并且还揭示了 Rab5 独立于细胞进行分化。我们发现，在GEF突变体中，观察到维管束发育不成熟和芥子细胞分化增强，与液泡SNARE突变体相似，细胞命运决定机制已被阐明2)。血管细胞和黑芥子细胞的冗余命运决定机制的分析——VAM3，一种液泡SNARE，有两个同源物，PEP12和SYP23，已被证明存在于液泡前室膜中。由于 SYP23 不具有跨膜区域，因此它位于细胞质中，不被认为是功能性 SNARE 或特异性决定血管细胞和黑芥子细胞的命运。申请人使用TDNA插入突变体和人工microRNA创建了VAM3、PEP12和SYP23的单突变体、双突变体和三突变体。双突变体显示出早期发育致死性。我们分析了突变体 VAM3、PEP12 和 SYP23 在所有性状中的植物生长（高度）、黑芥子细胞分化的增强、维管束的发育以及 12S 球蛋白向液泡的转运。从这些结果中，我们发现被认为是功能失调的 SNARE 的 SYP23 具有功能，因此我们分析了 SYP23 的细胞内定位及其形成 GFP 融合 SYP23 的 SNARE 复合物的能力。创建该基因并将其导入植物后，我们使用荧光显微镜发现 SYP23 定位于细胞质中，并且使用表达 GFP-SYP23 的植物进行免疫沉淀实验表明 SYP23 是 VTI11 和 SYP5 的 SNARE。具有完全不同亚细胞定位的蛋白质参与细胞命运决定机制。该研究结果在一次学术会议上发表。