神経変性疾患に関わる内在性脂質アルデヒドに関する基盤的研究

内源性脂醛参与神经退行性疾病的基础研究

基本信息

批准号：
11157211
负责人：
内田浩二
金额：
$ 0.77万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11157211/
关键词：
神経変性疾患酸化ストレス脂質過酸化反応アルデヒド

项目摘要

脂質由来の揮発性アルデヒドであり、遺伝毒性および変異原性などの生理活性が明らかにされているアクロレインについてタンパク質との反応を生理的条件下にて行い、アミノ酸分析装置(現有設備)などを用い修飾アミノ酸の特定を試みた。その結果、アクロレインとリジン誘導体との反応により生成される付加体について600MHz核磁気共鳴装置(NMR)および高速液体クロマトグラフィー-質量分析装置(LC-MS)などを用いた化学構造解析を行い、新規付加体としてFDP-lysineを同定した。さらに、FDP-lysineの化学構造解析をうけ、ポストラベル法などによる微量検出法について検討した結果、アミノ酸分析による蛋白質酸加水分解系における高感度検出を可能にした。一方、キャリアタンパク質としてkeyhole limpet hemocyaninを用い、構造の明らかになったFDP-lysineとのconjugateを作製し、付加体をハプテンとした抗ハプテンモノクローナル抗体の作製を行った。ハプテン-タンパク質結合体を免疫原としてマウスに免疫し、定法通りミエローマ細胞とマウス脾細胞の細胞融合からハイブリドーマを作製し、モノクローナル抗体産生細胞株を樹立し、モノクローナル抗体5F6を得た。本モノクローナル抗体を用いた免疫組織染色により、少なくともアルツハイマー病患者脳組織におけるFDP-lysineの存在が確認された。

丙烯醛是一种源自脂质的挥发性醛，已被证明具有遗传毒性和致突变性等生理活性，使用氨基酸分析仪（现有设备）等在生理条件下与蛋白质发生反应。我们尝试鉴定修饰氨基酸。因此，我们利用600MHz核磁共振（NMR）和高效液相色谱-质谱（LC-MS）分析了丙烯醛和赖氨酸衍生物反应生成的加合物的化学结构，发现新的FDP-赖氨酸被鉴定为加合物。此外，基于FDP-赖氨酸的化学结构分析，我们研究了标记后方法等痕量检测方法，结果，我们能够利用氨基酸分析在蛋白质酸水解系统中实现高灵敏度检测。另一方面，我们以匙孔血蓝蛋白为载体蛋白，制作了与结构已明确的FDP-赖氨酸的缀合物，并使用该加合物作为半抗原制作了抗半抗原单克隆抗体。以半抗原-蛋白缀合物作为免疫原免疫小鼠，通过骨髓瘤细胞和小鼠脾细胞以标准方式进行细胞融合产生杂交瘤，建立单克隆抗体产生细胞系，获得单克隆抗体5F6。使用这种单克隆抗体进行的免疫组织化学染色证实，至少在阿尔茨海默病患者的脑组织中存在 FDP-赖氨酸。