微小管モーターとその変異体を用いた分子モーター作用機構の階層論的研究

使用微管马达及其突变体进行分子运动作用机制的分层研究

基本信息

批准号：
11156219
负责人：
太和田勝久
金额：
$ 1.28万
依托单位：
Kyushu University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
财政年份：
1999
资助国家：
日本
起止时间：
1999 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11156219/
关键词：
分子モーター微小管キネシン NCD 揺らぎ解析歩行モデル

项目摘要

野性型の分子モーターは、細胞骨格繊維と相互作用すると、そのATP分野が活性化され、繊維の一方向性の滑り運動を生じる。分子モーターの或る変異体は、野性型分子モーターと同様にATP分解は繊維によって活性化されるが、繊維の一方向の滑り運動を起こすことが出来ず、繊維の一次元的な「双方向性」のランダム運動を起こす。これらの変異体によって生じる繊維の一次元的ランダム運動を非線型動力学的解析法などを用いて詳細に解析することにより、野性型分子モーターにあって、これらの変異体モーターに欠けているメカニズムを見いだし、分子モーターが活性化型ATP分解に共役して「一方向性」の滑り力を発生する仕組みの解明を目指すのが本研究の目的である。1.上記の特徴をもつ変異体分子モーターとして、微小管モーターの一つであるNCDの、柄部の短い変異体MC5を本研究で用いる。当初、大腸菌で発現して得たGST-MC5という融合タンパクからスロンビン処理でMC5を切り出したが、分子量的に少し異なる2種類のMC5を得た。スロンビンが融合タンパクの異なる2か所を切断するからであることがわかった(以上昨年度までに判明したこと)。そこで、単一分子量のMC5を得るために、大腸菌でMC5を直接発現することにした。あたらしくpET-MC5を構築し、MC5を大腸菌で発現させることに成功した。ただし、発現量はまだ少ない。今後、よりよい発現条件を探す必要がある。2.上記の研究に関して理論的研究も行っている。微小管モーターの歩行モデルの構築とその計算機シミュレーションである。歩行モデルを改良することにより、張力クランプ条件下におけるキネシン単分子の微小管上の滑り運動の特徴(Blockらの報告、'99)をすべて再現できた。たとえば、滑り速度のATP濃度依存性のKmが張力に依存することも再現できた。

当野生型分子马达与细胞骨架纤维相互作用时，它们的 ATP 场被激活，导致纤维单向滑动。分子马达的某种突变体，像野生型分子马达一样，被纤维激活进行ATP降解，但无法引起纤维的单向滑动运动，而是引起“性”的随机运动。通过使用非线性动力学分析方法详细分析这些突变体产生的纤维的一维随机运动，我们将揭示野生型分子马达中存在但这些突变体马达中缺乏的机制是本研究的目的。目的是发现分子马达与活化的 ATP 分解耦合并产生“单向”滑动力的机制。 1. 作为具有上述特征的突变分子马达，本研究中我们使用NCD的短柄突变体MC5，即微管马达。最初，通过凝血酶处理从大肠杆菌中表达的称为GST-MC5的融合蛋白中切除MC5，但获得了分子量略有不同的两种类型的MC5。事实证明，这是因为凝血酶在两个不同的位置切割融合蛋白（这是去年发现的）。因此，为了获得单一分子量的MC5，我们决定直接在大肠杆菌中表达MC5。我们新构建了pET-MC5，并成功在大肠杆菌中表达MC5。然而，表达水平仍然较低。未来有必要寻找更好的表达条件。 2、针对上述研究，我们也在进行理论研究。微管电机行走模型的构建及其计算机模拟。通过改进步行模型，我们能够重现张力夹条件下微管上单个驱动蛋白分子滑动运动的所有特征（Block 等人，'99）。例如，我们能够再现 Km（滑动速度的 ATP 浓度依赖性）对张力的依赖性。