糖鎖-オリゴDNA複合体を用いたアンチセンスオリゴDNAの細胞ターゲッティング

使用糖链-寡聚 DNA 复合物对反义寡聚 DNA 进行细胞靶向

• 批准号: 11132222
• 负责人: 鈴木 徹
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Gifu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1999
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1999 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-11132222/
• 关键词: アンチセンスオリゴヌクレオチド; PNA; 無細胞タンパク質合成; 糖鎖-オリゴDNA複合体; GFP; CAT

アンチセンス法にペプチド核酸(PNA)を応用する為に、PNAとDNAの二重らせん形成能を、表面プラズモン共鳴法を用いて評価した。相補的なDNA、PNA及び、一塩基変異のあるDNAとPNAを用い、結合と解離の速度を表面プラズモン共鳴法で測定した。その結果、DNAにおいては一塩基の変異によって親和性(Ka/Kd)が50%ほど変化しか変化しないのに対し、PNAでは、97%も変化した。このことから、PNAは、わずかな塩基の違いをより強く認識できることが明らかになった。また、アンチセンスのターゲット配列を迅速に決定するため、GFPキメラタンパク質を用いたin vitroアンチセンス評価系を構築した。昨年度の本研究で、我々は緑色蛍光タンパク質(GFP)及び、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ(CAT)を用いたアンチセンスオリゴDNAのin vitro評価系を構築した。今回は、これをキメラタンパク質にも、準用できるか否かを検討した。CAT遺伝子の下流に半減期が2時間になるように改変されたGFPを結合した遺伝子を構築した。上流のCAT遺伝子を制御するS-オリゴDNA及び、PNAをin vitroタンパク質合成系に加えたところCAT遺伝子単独の場合と同様にキメラ遺伝子が発現抑制されることが、GFPの蛍光強度として観察された。本実験系を用いることで、通常評価に時間とコストがかかる遺伝子に関して、ターゲット配列の決定を格段に容易にすることが可能になると考えられる。

为了将肽核酸（PNA）应用于反义方法，使用表面等离子共振评估了PNA和DNA形成双螺旋的能力。使用互补 DNA、PNA、具有单核苷酸突变的 DNA 和 PNA，使用表面等离子共振测量结合和解离率。因此，在 DNA 中，亲和力 (Ka/Kd) 仅因单核苷酸突变而变化约 50%，而在 PNA 中，亲和力 (Ka/Kd) 变化高达 97%。这表明 PNA 可以更强烈地识别碱基的细微差异。此外，为了快速确定反义靶序列，我们利用GFP嵌合蛋白构建了体外反义评估系统。在去年的这项研究中，我们利用绿色荧光蛋白（GFP）和氯霉素乙酰转移酶（CAT）构建了反义寡聚DNA的体外评价系统。这次，我们研究了这是否也可以应用于嵌合蛋白。在CAT基因下游构建了一个基因，其中GFP被修饰为具有2小时的半衰期。当控制上游CAT基因和PNA的S-oligo DNA被添加到体外蛋白质合成系统中时，嵌合基因的表达以与单独使用CAT基因时相同的方式被抑制，如在荧光强度中观察到的绿色荧光蛋白。人们认为，通过使用该实验系统，将有可能显着促进通常需要时间和成本来评估的基因靶序列的确定。