超音波処理によるアミロイド線維形成を指標としたプリオンの新規迅速検出法

以超声波淀粉样原纤维形成为指标的朊病毒快速检测新方法

• 批准号: 25502004
• 负责人: 村山 裕一
• 金额: $ 3.33万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25502004/
• 关键词: 異常プリオン蛋白質; 牛海綿状脳症; アミロイド線維; 超音波処理; チオフラビンT; アミロイド繊維

クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）や牛海綿状脳症（BSE）などのプリオン病の病原体は、高次構造が変化した異常プリオン蛋白質（PrPSc）である。本研究では、超音波処理により、PrPScを核として急速にアミロイド線維が形成される反応を利用し、短時間でかつ高感度にPrPScを検出できる簡便で安全な検出方法を開発する。26年度は、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウス、牛あるいはマウスプリオン蛋白質過発現マウス由来の10%脳乳剤にチオフラビンＴ（ThT, 5μM）を添加し、全自動蛋白質異常凝集インデューサー装置 (Hanabi)を用いて蛍光測定（Ex:445nm, Em:485nm）、超音波処理（15秒照射-1秒休止を5回）、培養（37℃、1時間）の工程を10回繰り返した。また、各脳乳剤を1% Triton Xおよび4 mM EDTAを含むPBSで1:7に希釈したサンプルも同様に解析した。その結果、緩衝液で希釈したプリオン蛋白質過発現マウスの脳乳剤は基質として有効であり、定型BSEおよびL型非定型BSE由来PrPSc（1/1000希釈）の場合、デキストラン硫酸ナトリウム（0.5-1%)を添加することによって、反応開始後２～３時間で急速なThT蛍光の上昇が認められた。27年度は、ウェル間のばらつきを検証し、反応が良好なウェルを選別した。さらに超音波照射を均一化する目的で、X軸方向にウェルを±8 mm振盪した。ウシリコンビナントプリオン蛋白質（25μg/ml）を1% Triton Xおよび4mM EDTAを含むPBSで希釈し、ThTを加えたものを基質として用いた。またポリアニオンやアルギニンを基質に加え、その効果を検討した。その結果、リコンビナントプリオン蛋白質を基質に用いた場合、L型およびH型非定型BSEプリオンの検出が１～３時間で可能になった。

prion病的病原体，例如Creutzfeldt-Jakob病（CJD）和牛海绵状脑病（BSE）的病原体是具有改变构象的异常prion蛋白（PRPSC）。在这项研究中，我们将开发一种简单且安全的检测方法，该方法可以在短时间内检测PRPSC，并通过使用超声处理以迅速形成PRPSC作为核的淀粉样蛋白纤维来检测高灵敏度。在2014年，将硫非激动T（Tht，5μm）添加到源自prion蛋白基因基因敲除小鼠，牛或小鼠prion蛋白过表达小鼠的10％脑乳液中，以及荧光测量的步骤（例如：445nm，EM：485nm：485nm），超声处理（485nm），超声处理（5次）。 1小时重复10次。还类似地分析了每种脑乳液在包含1％Triton X和4 mM EDTA的PBS中稀释1：7的样品。结果，在缓冲液中稀释的过表达prion蛋白的小鼠的脑乳液作为底物有效，并且在源自BSE型和L型非典型BSE（稀释的1/1000）的PRPSC的情况下，在添加硫代硫酸盐的反应后2-3个小时，荧光迅速增加了2-3个小时。在2015财年，我们检查了井和选定的井之间的变化，并有良好的反应。此外，为了使超声辐射均匀，孔在X轴方向上摇晃±8 mm。将USILICON二个prion蛋白（25μg/mL）稀释在包含1％Triton X和4 mM EDTA的PBS中，并将TH添加为底物。此外，将多晶和精氨酸添加到底物中，并研究了它们的作用。结果，当将重组prion蛋白用作底物时，可以在1-3小时内检测L型和H型非典型BSE Prions。