超音波処理によるアミロイド線維形成を指標としたプリオンの新規迅速検出法

以超声波淀粉样原纤维形成为指标的朊病毒快速检测新方法

• 批准号: 25502004
• 负责人: 村山 裕一
• 金额: $ 3.33万
• 依托单位: National Agriculture and Food Research Organization
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2013
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2013-04-01 至 2016-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-25502004/
• 关键词: 異常プリオン蛋白質; 牛海綿状脳症; アミロイド線維; 超音波処理; チオフラビンT; アミロイド繊維

クロイツフェルト・ヤコブ病（CJD）や牛海綿状脳症（BSE）などのプリオン病の病原体は、高次構造が変化した異常プリオン蛋白質（PrPSc）である。本研究では、超音波処理により、PrPScを核として急速にアミロイド線維が形成される反応を利用し、短時間でかつ高感度にPrPScを検出できる簡便で安全な検出方法を開発する。26年度は、プリオン蛋白質遺伝子ノックアウトマウス、牛あるいはマウスプリオン蛋白質過発現マウス由来の10%脳乳剤にチオフラビンＴ（ThT, 5μM）を添加し、全自動蛋白質異常凝集インデューサー装置 (Hanabi)を用いて蛍光測定（Ex:445nm, Em:485nm）、超音波処理（15秒照射-1秒休止を5回）、培養（37℃、1時間）の工程を10回繰り返した。また、各脳乳剤を1% Triton Xおよび4 mM EDTAを含むPBSで1:7に希釈したサンプルも同様に解析した。その結果、緩衝液で希釈したプリオン蛋白質過発現マウスの脳乳剤は基質として有効であり、定型BSEおよびL型非定型BSE由来PrPSc（1/1000希釈）の場合、デキストラン硫酸ナトリウム（0.5-1%)を添加することによって、反応開始後２～３時間で急速なThT蛍光の上昇が認められた。27年度は、ウェル間のばらつきを検証し、反応が良好なウェルを選別した。さらに超音波照射を均一化する目的で、X軸方向にウェルを±8 mm振盪した。ウシリコンビナントプリオン蛋白質（25μg/ml）を1% Triton Xおよび4mM EDTAを含むPBSで希釈し、ThTを加えたものを基質として用いた。またポリアニオンやアルギニンを基質に加え、その効果を検討した。その結果、リコンビナントプリオン蛋白質を基質に用いた場合、L型およびH型非定型BSEプリオンの検出が１～３時間で可能になった。

克雅氏病（CJD）和牛海绵状脑病（BSE）等朊病毒病的病原体是一种高阶结构发生改变的异常朊病毒蛋白（PrPSc）。在本研究中，我们将开发一种简单、安全的检测方法，利用超声处理导致以 PrPSc 为核心的淀粉样原纤维快速形成的反应，可以在短时间内高灵敏度检测 PrPSc。 2016财年，我们在来自朊病毒蛋白基因敲除小鼠、牛或过度表达小鼠朊病毒蛋白的小鼠的10%脑乳剂中添加硫黄素T（ThT，5μM），并使用全自动蛋白质聚集诱导装置（Hanabi）进行测量。例如：445nm， Em：485 nm）、超声处理（15秒照射-1秒暂停5次）和培养（37℃，1小时）重复10次。此外，对用含有1% Triton X和4 mM EDTA的PBS 1:7稀释各脑乳剂的样品进行类似分析。结果，来自过表达朊病毒蛋白的小鼠的脑乳剂在缓冲液中稀释，作为底物是有效的，对于典型 BSE 和 L 非典型 BSE 衍生的 PrPSc（1/1000 稀释），葡聚糖硫酸钠（0.5-1%） ，反应开始后2至3小时观察到ThT荧光快速增加。 2017财年，我们验证了井之间的差异以及反应良好的选定井。此外，为了使超声波照射均匀，沿X轴方向摇动各孔±8mm。将牛硅二元朊病毒蛋白(25μg/ml)用含有1％Triton X和4mM EDTA的PBS稀释，并向其中添加ThT并用作底物。我们还在底物中添加了聚阴离子和精氨酸并研究了它们的影响。结果，当使用重组朊病毒蛋白作为底物时，可以在1至3小时内检测出L型和H型非典型BSE朊病毒。