繰り返し凍結、解凍が可能なクライオ光学顕微鏡の開発

开发可重复冷冻和解冻的冷冻光学显微镜

基本信息

批准号：
10878114
负责人：
船津高志
金额：
$ 1.34万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Exploratory Research
财政年份：
1998
资助国家：
日本
起止时间：
1998 至 1999
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10878114/
关键词：
赤外線レーザー蛍光顕微鏡急速凍結ブラウン運動

项目摘要

生体試料を冷却・凍結できる顕微鏡の作製と評価を昨年度に終え、今年度は加熱法の検討を行った。生体試料を局所的に高時間分解能で加熱するためには、赤外線レーザーを用いることが有効である。特に、水分子の吸収波長である1,500nm付近の赤外線レーザーを対物レンズで集光させることにより、生物試料を非侵襲的に加熱することが可能である。そこで、オリンパス光学工業の倒立顕微鏡IX70を改造し、出力2Wの赤外ラマンレーザ(波長1,460nm)を照射するための赤外レーザー顕微鏡システムを組み立てた。実際に、50〜55℃でゾル-ゲル相転移するメチルセルロース水溶液に対物レンズを用いて赤外線を集光させたところ半径〜10μmの局所領域でゲル化が起こった。以上の結果から、局所領域を周囲より40℃以上も加熱できることを確認した。緑色蛍光タンパク質(GFP)を発現している細胞に赤外線レーザーを照射すると温度の上昇にともなってGFPの蛍光強度が減少した。この現象を利用して局所領域の温度を測定できることもわかった。試料の3次元的な温度分布を測定するために既存の共焦点蛍光顕微鏡に赤外線レーザー顕微鏡システムを組み込んだ。これにより、生物試料を冷却、加熱(凍結、解凍)できるシステムが構築できた。

去年，我们完成了可以冷却和冷冻生物样本的显微镜的构建和评估，今年我们研究了加热方法。为了以高时间分辨率局部加热生物样品，使用红外激光是有效的。特别是，通过用物镜将红外激光聚焦在1,500 nm（水分子的吸收波长）附近，可以非侵入地加热生物样品。因此，我们改造了奥林巴斯光学工业公司制造的倒置显微镜IX70，并组装了红外激光显微镜系统，用于用输出为2W的红外拉曼激光（波长1,460 nm）照射。事实上，当使用物镜将红外线聚焦到在 50-55°C 发生溶胶-凝胶相变的甲基纤维素水溶液上时，在半径约为 10 μm 的局部区域发生凝胶化。根据以上结果，我们确认与周围区域相比，可以将局部区域加热 40°C 或更高。当用红外激光照射表达绿色荧光蛋白（GFP）的细胞时，GFP的荧光强度随着温度的升高而降低。人们还发现，这种现象可以用来测量局部区域的温度。将红外激光显微镜系统集成到现有的共焦荧光显微镜中，以测量样品的三维温度分布。因此，我们能够构建一个可以冷却和加热（冷冻和解冻）生物样品的系统。