アダプター分子STAP-2によるT細胞活性制御機構の解明

阐明接头分子STAP-2调节T细胞活性的机制

基本信息

批准号：
23590065
负责人：
関根勇一
金额：
$ 3.49万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2011
资助国家：
日本
起止时间：
2011 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

これまでに、アダプター分子Signal-transducing adaptor protein-2(STAP-2)がさまざまな細胞内シグナル伝達経路において機能的に働き、サイトカイン刺激による免疫細胞応答を調節する重要な分子であることを申請者は多数報告している。特にT細胞においてSTAP-2が重要な働きをしていることを数多く示してきた。本申請研究において、STAP-2によるT細胞の活性制御機構の更なる解明と、アポトーシスシグナル経路におけるSTAP-2の機能解析を行った。1.STAP-2によるアポトーシス促進メカニズムの解明これまでの研究では、Fas刺激時のCaspase活性がSTAP-2により亢進することを明らかにしており、本年度の研究によりアポトーシス促進メカニズムの解明を行った。STAP-2自身は酵素活性を持たないことから、Caspaseを活性化する分子とSTAP-2との複合体形成が一つのメカニズムとして考えられた。アポトーシスのイニシエーターであるCaspase-8は、刺激によるFasの活性化によりFADDというアダプター分子を介してレセプターへリクルートされ、DISCと呼ばれる複合体の中で活性化する。そこでSTAP-2がCaspaseの活性化を促進するメカニズムを解明するため、ヒト白血病T細胞株Jurkat細胞、STAP-2 KO T細胞、ヒト胎生腎癌細胞株293T細胞を用いて、免疫沈降実験などによりDISC形成分子とSTAP-2の相互作用解析等を行った。その結果、STAP-2はFasやCaspase-8と会合し、DISC形成を促進することを明らかにした。これよりSTAP-2によるアポトーシス促進は、DISC形成亢進によることが明らかになった。2.STAP-2限定分解酵素の同定これまでに申請者は、Jurkat細胞においてFas誘導性アポトーシス時に切断されたSTAP-2産物の分子量から、切断部位を推測しアミノ酸に変異を導入することで限定分解されないSTAP-2点変異体の作製に成功していた。この切断配列は、アポトーシス時に活性化するシステインプロテアーゼ、Caspaseファミリーによって認識される配列と相同性が高く、また、広範なCaspaseインヒビターとして知られるzVAD処理により、STAP-2の限定分解が抑制されることも予備実験により明らかにしていた。これら知見からCaspaseファミリー分子がSTAP-2の限定分解酵素であると考えられた。本年度の研究ではCaspaseファミリー特異的インヒビターを用いた解析、siRNAによるノックダウン実験によって、Caspase-8がSTAP-2切断酵素であることを同定した。今後は、STAP-2が切断されることとアポトーシス促進の関連性、及びSTAP-2切断阻害剤の作製によりアポトーシスへの影響を解析していく予定である。アポトーシス時におけるSTAP-2限定分解の詳細な解析が、STAP-2限定分解の調節による自己免疫疾患の治療薬開発の手がかりになることを期待する。

迄今为止，申请人已证明接头分子信号转导接头蛋白-2(STAP-2)在多种细胞内信号转导途径中发挥功能，并且是调节细胞因子刺激诱导的免疫细胞反应的重要分子，已被广泛报道。。特别是，STAP-2 已被证明在 T 细胞中发挥重要作用。在本次提交的研究中，我们进一步阐明了STAP-2控制T细胞活性的机制，并分析了STAP-2在凋亡信号通路中的功能。 1. 阐明STAP-2促进细胞凋亡的机制以往的研究表明，STAP-2在Fas刺激下可增强Caspase活性，今年的研究阐明了STAP-2促进细胞凋亡的机制。由于 STAP-2 本身不具有酶活性，一种可能的机制是 STAP-2 与激活 caspase 的分子之间形成复合物。 Caspase-8 是细胞凋亡的引发剂，当 Fas 受到刺激而被激活时，它会通过称为 FADD 的接头分子被招募到受体上，并在称为 DISC 的复合物中被激活。因此，为了阐明STAP-2促进caspase激活的机制，我们使用人白血病T细胞系Jurkat细胞、STAP-2 KO T细胞和人胚胎肾癌细胞系293T细胞进行了免疫沉淀实验，并进行了相互作用。 DISC 形成分子和 STAP-2 之间的分析。结果表明，STAP-2 与 Fas 和 caspase-8 结合并促进 DISC 形成。这些结果表明STAP-2促进细胞凋亡是由于DISC形成的增强。 2.STAP-2限制酶的鉴定迄今为止，申请人已经从Jurkat细胞中Fas诱导的细胞凋亡过程中裂解的STAP-2产物的分子量估计了裂解位点，并通过向氨基酸中引入突变来分离它们。已成功创建了未降解的 STAP-2 点突变体。该裂解序列与 caspase 家族识别的序列具有高度同源性，caspase 家族是细胞凋亡过程中激活的半胱氨酸蛋白酶，用被称为广谱 caspase 抑制剂的 zVAD 处理可抑制 STAP-2 的有限降解。初步实验也揭示了这一点。这些发现表明 Caspase 家族分子是 STAP-2 的有限降解酶。在今年的研究中，我们通过使用 caspase 家族特异性抑制剂的分析和使用 siRNA 的敲低实验，将 caspase-8 鉴定为 STAP-2 裂解酶。未来，我们计划分析STAP-2裂解与细胞凋亡促进之间的关系，以及通过创建STAP-2裂解抑制剂对细胞凋亡的影响。我们希望对细胞凋亡过程中STAP-2有限降解的详细分析将为通过调节STAP-2有限降解来开发自身免疫性疾病治疗药物提供线索。