組織標本上での遺伝子特定部位のメチル化シトシンin situ検出法の開発

组织标本特定基因位点甲基化胞嘧啶原位检测方法的建立

基本信息

批准号：
19659086
负责人：
北澤荘平
金额：
$ 1.98万
依托单位：
Kobe University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Challenging Exploratory Research
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19659086/
关键词：
組織標本メチル化シトシン遺伝子プロモータ in situ hybridization

项目摘要

単一の受精卵に由来しながら、神経細胞から皮膚に至る多種多様な組織細胞分化が起こるメカニズムには。エピジェネティクス制御が重要とされている。メチル化シトシンは、エピジェネティクス制御機構の主体をなすDNA修飾であり、組織細胞分化や再生医療のみならず、腫瘍発生・進展においても重要である。特に、癌の個性に応じた薬物療法として、近年ではDNAメチル化阻害剤の適応について検索する手法が重要となる。私どもは、対象遺伝子の調節領域に存在するCpG-islandのシトシンメチル化を、細胞や組織の形態を維持したまま、in situで検出する組織化学的方法の開発についての検討を行った。本年度は、部位特異的DNAメチル化に対して、メチル化シトシンとオスミウム酸により錯体形成するICONプローブ(bipyridine-adenine標識プローブ)に着目し、染色体上で標的DNAとICONプローブとを結合させて、強固な化学結合で固定し、このICONプローブをもとに染色体上でPRINS法を行う実験系を構築することを目指して予検討を行った。染色体上でICONプローブをもとにPCR反応を行う際に、標識化合物を取り込ませた後、標識化合物に対する免疫組織化学にてシグナルを検出する。特異的で高感度のプローブ結合やPCR反応、メチル化シトシン-標識グアニン複合体に対する単クローン抗体の作成が課題となる。本年度は、単クローン抗体作成法の予検討と、染色体標本上でのPRINS法施行についての検討を行った。特に、標本の固定やheat denatureの条件設定や、標本上でのDNA合成進展に最適な酵素試薬の検定などを施行した。効率的なマウス免疫方法や、脾臓リンパ球回収、ミエローマ細胞との細胞融合、HAT培地による選択培養については、最適な実験系を整備することが出来た。

为了导致从单个受精卵衍生的神经细胞到皮肤的各种组织细胞分化的机制。表观遗传学控制很重要。甲基化citcoin是一种DNA修饰，是表观遗传学控制机制的主题，它不仅在组织细胞分化和再生医学中很重要，而且在肿瘤的产生和进展中也很重要。特别是，作为一种药物疗法，根据癌症的人格，近年来寻找DNA甲基化抑制剂的适应非常重要。我们已经检查了原位检测到的组织化学方法的发展，同时维持存在于靶基因协调区域中的细胞和组织的cityosymetylation。今年，重点是图标Pro（双吡啶 - 腺苷探针），该Pro响应于部分特异性DNA甲基化而形成的，将靶DNA和图标响应于染色体上牢固的化学键，我们进行了一个预测，目的是建立一个基于此图标探针的染色体上执行Prins方法的实验系统。当PCR基于对染色体的图标探针的反应时，通过免疫系统化学对符号化合物检测信号。面临的挑战是为特定和高敏感性探针键，PCR反应和甲基化Citocin签名的Genin复合物创建单个Crone抗体。今年，我们研究了创建单一克隆抗体的方法以及对染色体标本的Prins定律的执行。特别是，进行了试样固定，热致命的条件设置以及对试样中DNA合成最佳的酶试剂的测试。有效的小鼠免疫方法，脾淋巴细胞，与Mieloma细胞的细胞融合以及通过HAT培养基选择的培养物，我们能够开发最佳的实验系统。