F1-ATPaseによる生体分子モーターの化学－力学エネルギー変換機構の解明

F1-ATPase 阐明生物分子马达的化学机械能转换机制

基本信息

批准号：
17K07371
负责人：
足立健吾
金额：
$ 3.24万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
财政年份：
2017
资助国家：
日本
起止时间：
2017-04-01 至 2018-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

生体分子モーターは基質となるヌクレオチドの加水分解エネルギーを利用して働いている。その仕掛けを探りたい。ATP駆動型の分子モーターでは、活性部位でのATP、ADP・Pi、ADP、Pi、emptyといったそれぞれの化学状態に応じた力を化学サイクルに沿って発生することで一方向に動くと考えられている。力発生の設計図とでも言うべきポテンシャルエネルギーをすべてのヌクレオチド化学状態について決定することで、分子モーターの化学－力学エネルギー変換の本質的理解に迫りたい。具体的には、回転分子モーターF1-ATPaseを用いて、活性部位３箇所の化学状態を同定しながら発生するトルクを1分子測定し、最終的に化学状態ごとのポテンシャルエネルギーを回転角度の関数として決定することを試みた。ガラス表面に固定したF1の回転軸に磁気ビーズを取り付け、磁気ピンセットで作る外部磁場によってATP加水分解または合成の方向に一定速度で回転させながら、F1の出すトルク（回転力）を測定した。磁気ビーズの、磁場の向きからのズレがF1の出すトルクであり、ATP待ちの角度を基準として0から360度の回転角度の関数として求めた。同時に、蛍光性ヌクレオチドを用いてどの活性部位に結合しているのかを偏光・デフォーカス蛍光イメージングによって1分子観察した。結合ヌクレオチド無しの状態とADP1個を結合した状態の測定に成功している。また、ヌクレオチドの結合定数を用いた別のポテンシャル決定法からも同様の結果となることが確認できている。

生物分子马达利用核苷酸水解的能量作为底物来工作。我想知道它是如何工作的。 ATP驱动的分子马达被认为通过根据ATP、ADP/Pi、ADP、Pi和空在化学循环中的活性位点的化学状态产生力而朝一个方向移动。通过确定核苷酸所有化学状态的势能（可称为力产生的蓝图），我们的目标是对分子马达中的化学机械能转换有一个基本的了解。具体来说，使用旋转分子马达 F1-ATPase，我们测量了每个分子产生的扭矩，同时识别了三个活性位点的化学状态，最后计算了每个化学状态的势能作为我尝试的旋转角度的函数。决定。将磁珠固定在固定在玻璃表面上的F1的旋转轴上，利用产生的外部磁场，以ATP水解或合成的方向以恒定速度旋转F1，并测量F1产生的扭矩（旋转力）通过磁力镊子。磁珠偏离磁场方向的偏差即为F1产生的扭矩，以ATP等待角为参考，确定0至360度旋转角度的函数。同时，我们使用偏振和散焦荧光成像来观察使用荧光核苷酸的单个分子，以确定它们结合到哪个活性位点。我们成功地测量了没有结合核苷酸的状态和有一个 ADP 结合的状态。此外，已经证实另一种使用核苷酸结合常数的潜在测定方法可以产生类似的结果。