微生物代謝産物からの抗結核物質の探索と作用点の解明

从微生物代谢物中寻找抗结核物质并阐明其作用点

• 批准号: 16K08303
• 负责人: 三浦 広美
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16K08303/
• 关键词: 抗結核薬; ジアミノピメリン酸合成経路; アルギニン修飾シリカゲル; 親水性相互作用クロマトグラフィー; 天然活性物質; 多剤耐性結核

抗結核薬の新たな標的として、細菌のペプチドグリカンの構成成分であるジアミノピメリン酸 (DAP) の合成経路に着目した先行研究（「微生物二次代謝産物からの新抗結核薬の探索」平成26-27年度、挑戦的萌芽研究）にてStreptomyces sp. K12-0214の培養液を候補として見出し、本研究で活性物質の単離・精製を進めた。本活性物質は水溶性で、通常単離に汎用されているODS、silica、HP20などの樹脂では分離が困難であったため、水溶性物質の単離に応用できそうな種々の樹脂と溶出条件を用いて精製条件の検討を行った。その結果、Arg修飾silica樹脂を用いて親水性相互作用クロマトグラフィー(Hydrophilic Interaction Chromatography=HILIC)で溶出することにより、比活性が20倍に上昇した画分を得ることができた。 この画分をBio-gel P-10を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにて分画したところ、さらに比活性が上昇した画分を得ることができた。溶出容量からこの活性物質は分子量＞700であると推測された。このBio-gel P-10活性画分についてNMR測定を試みたが、複数の物質が混在しており構造の推定には至らなかった。過去の文献の情報より、有機酸の可能性が考えられたため、種々の標品 (乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、ピルビン酸、コハク酸)とともに薄層クロマトグラフィーを行って比較したが、いずれとも一致しなかった。これまでに得られた知見より、本活性物質は水溶性物質で分子量は700より大きく、塩基性条件下で活性が減弱する。さらに抗菌スペクトルの特徴（M. smegmatis および E. coli に抗菌活性を示し、S. aureus には抗菌活性を示さない）からも、既存の抗結核薬や有機酸とは異なる物質であることが強く示唆された。

前期研究重点关注细菌肽聚糖成分二氨基庚二酸（DAP）的合成途径，作为抗结核药物的新靶点（“从微生物次级代谢产物中寻找新的抗结核药物”）2014-27 2013年，我们利用链霉菌K12-0214的培养液作为候选物（具有挑战性的探索性研究），并进行了本研究中活性物质的分离和纯化。该活性物质是水溶性的，使用常用的分离树脂（例如ODS、硅胶和HP20）很难将其分离，因此，我们开发了可应用于水溶性物质分离的各种树脂和洗脱条件。使用该方法研究了物质的纯化条件。结果，通过使用Arg改性二氧化硅树脂的亲水相互作用色谱（HILIC）洗脱，我们能够获得比活性增加20倍的级分。 当使用Bio-gel P-10通过凝胶过滤色谱法对该级分进行分级时，可以获得比活性进一步增加的级分。根据洗脱体积估计活性物质的分子量>700。尝试对这种 Bio-gel P-10 活性组分进行 NMR 测量，但存在多种物质，无法估计其结构。根据以往文献的信息，我们认为它可能是一种有机酸，因此我们对各种样品（乳酸、苹果酸、酒石酸、柠檬酸、丙酮酸和琥珀酸）进行了薄层色谱分析并进行了比较没有一个匹配。根据目前掌握的知识，该活性物质是一种分子量大于700的水溶性物质，在碱性条件下活性降低。此外，其抗菌谱特征（对耻垢分枝杆菌和大肠杆菌具有抗菌活性，但对金黄色葡萄球菌没有抗菌活性）强烈表明它是一种不同于现有抗结核药物和有机酸的物质。