微生物代謝産物からの抗結核物質の探索と作用点の解明

从微生物代谢物中寻找抗结核物质并阐明其作用点

• 批准号: 16K08303
• 负责人: 三浦 広美
• 金额: $ 3.08万
• 依托单位: Kitasato University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 2016
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2016-04-01 至 2018-03-31
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16K08303/
• 关键词: 抗結核薬; ジアミノピメリン酸合成経路; アルギニン修飾シリカゲル; 親水性相互作用クロマトグラフィー; 天然活性物質; 多剤耐性結核

抗結核薬の新たな標的として、細菌のペプチドグリカンの構成成分であるジアミノピメリン酸 (DAP) の合成経路に着目した先行研究（「微生物二次代謝産物からの新抗結核薬の探索」平成26-27年度、挑戦的萌芽研究）にてStreptomyces sp. K12-0214の培養液を候補として見出し、本研究で活性物質の単離・精製を進めた。本活性物質は水溶性で、通常単離に汎用されているODS、silica、HP20などの樹脂では分離が困難であったため、水溶性物質の単離に応用できそうな種々の樹脂と溶出条件を用いて精製条件の検討を行った。その結果、Arg修飾silica樹脂を用いて親水性相互作用クロマトグラフィー(Hydrophilic Interaction Chromatography=HILIC)で溶出することにより、比活性が20倍に上昇した画分を得ることができた。 この画分をBio-gel P-10を用いてゲルろ過クロマトグラフィーにて分画したところ、さらに比活性が上昇した画分を得ることができた。溶出容量からこの活性物質は分子量＞700であると推測された。このBio-gel P-10活性画分についてNMR測定を試みたが、複数の物質が混在しており構造の推定には至らなかった。過去の文献の情報より、有機酸の可能性が考えられたため、種々の標品 (乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、ピルビン酸、コハク酸)とともに薄層クロマトグラフィーを行って比較したが、いずれとも一致しなかった。これまでに得られた知見より、本活性物質は水溶性物質で分子量は700より大きく、塩基性条件下で活性が減弱する。さらに抗菌スペクトルの特徴（M. smegmatis および E. coli に抗菌活性を示し、S. aureus には抗菌活性を示さない）からも、既存の抗結核薬や有機酸とは異なる物質であることが強く示唆された。

In a previous study focusing on the synthetic route of diaminopimelic acid (DAP), a component of the bacterial peptidoglycan (2014-2015), as a new target for antituberculous drugs, (Challenging new antituberculous drugs from microbial secondary metabolites), as a new target for antituberculous drugs, we found a candidate culture medium for Streptomyces sp. K12-0214作为候选人，在这项研究中，我们进行了活性物质的隔离和纯化。这种活性物质是水溶性的，很难用ODS，二氧化硅和HP20的树脂分离，这些树脂通常用于分离，因此使用各种可以应用于分离水溶性物质和洗脱条件的树脂检查纯化条件。结果，通过使用ARG修饰的二氧化硅树脂用亲水相互作用色谱（Hilic）洗脱特异性活性增加20倍的比例。使用Bio-Gel P-10，通过凝胶过滤色谱法分割了这一馏分，并获得了具有增加特定活性的部分。洗脱体积估计为该活性材料的分子量> 700。尝试在此Bio-Gel P-10的活性分数上尝试NMR测量值，但由于将多种物质混合在一起，因此未估计结构。由于基于以前文献的信息考虑了有机酸的可能性，因此我们与各种样品（乳酸，苹果酸，tart酸，柠檬酸，柠檬酸，丙酮酸，琥珀酸）进行了薄层色谱法，以对其进行比较，但它们都不一致。根据到目前为止获得的发现，这种活性物质是一种水溶性物质，其分子量超过700，其活性在基本条件下降低。此外，抗菌光谱的特征（在smegmatis和大肠杆菌中表现出抗菌活性，而不是金黄色葡萄球菌中的抗菌活性）强烈表明，它与现有的抗结核药物和有机酸的物质不同。