パルミトイル化脂質修飾による膜マイクロドメイン形成機構の解明

通过棕榈酰化脂质修饰阐明膜微区形成机制

基本信息

批准号：
12J02352
负责人：
関谷敦志
金额：
$ 1.92万
依托单位：
The Graduate University for Advanced Studies
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2012
资助国家：
日本
起止时间：
2012-04-01 至 2015-03-31
项目状态：
已结题

项目摘要

タンパク質のパルミトイル化修飾はタンパク質に飽和脂肪酸であるパルミチン酸が結合する翻訳後修飾で、パルミトイル化酵素と脱パルミトイル化酵素により触媒される可逆的修飾である。これまでのプロテオミクス研究から膨大量のパルミトイル化タンパク質が同定され、それらの多くが膜マイクロドメインに集積することが報告された。そのため、近年さまざまな分野で注目されている。しかしながら、この修飾系の一翼を担う脱パルミトイル化酵素は長年発見されておらず、そのパルミトイル化可逆的サイクルの詳細な解析には至れていない。昨年度申請者は、包括的な手法から脱パルミトイル化酵素の候補遺伝子群の単離に成功した。本年度は、これら候補遺伝子群の神経細胞における挙動を明らかにすることを目指した。神経細胞のポストシナプス膜に見られるポストシナプス後肥厚は典型的な膜マイクロドメインのひとつである。申請者はポストシナプス後肥厚の主要な構成成分で、パルミトイル化基質であるPSD-95に着目し、脱パルミトイル化候補遺伝子群の解析をおこなった。まず、脱パルミトイル化酵素活性を示す候補遺伝子群の神経細胞内局在をGFP融合タンパク質を用いて観察した。その結果、ポストシナプス膜近傍に選択的に局在するサブファミリーが存在することを明らかにした。PSD-95はポストシナプス膜近傍において脱パルミトイル化をされるため、これらのサブファミリーが主たる候補として考えられる。そこで、ポストシナプス膜に局在するサブファミリーを神経細胞に過剰発現させると、PSD-95のパルミトイル化レベルが減少し、ポストシナプスへの集積が著しく減少していた。そこで、ポストシナプス膜に局在する3つのサブファミリーメンバーのうち主要な遺伝子を特定するため、定量性PCR法により遺伝子発現量を比較定量した。その結果、神経細胞では1つの遺伝子が選択的に発現していることが分かった。現在、脱パルミトイル化候補遺伝子を欠損する神経細胞を作製し、生理的な意義の解明を目指している。

蛋白质的棕榈酰化修饰是饱和脂肪酸棕榈酸附着在蛋白质上的翻译后修饰，是由棕榈酰化酶和脱棕榈酰化酶催化的可逆修饰。先前的蛋白质组学研究已经鉴定出大量棕榈酰化蛋白质，其中许多已被报道在膜微域中积累。因此，近年来受到各个领域的关注。然而，在该修饰系统中发挥作用的去棕榈酰化酶多年来一直没有被发现，并且尚未实现对其可逆棕榈酰化循环的详细分析。去年，申请人采用综合方法成功分离出一组去棕榈酰化酶的候选基因。今年，我们的目标是阐明这些候选基因在神经元中的行为。在神经元突触后膜中观察到的突触后增厚是典型的膜微区。申请人重点关注突触后增厚的主要成分和棕榈酰化底物PSD-95，并分析了去棕榈酰化的候选基因。首先，我们使用 GFP 融合蛋白观察了表现出去棕榈酰化酶活性的候选基因的神经元内定位。结果揭示了一个选择性定位于突触后膜附近的亚科的存在。由于 PSD-95 在突触后膜附近被去棕榈酰化，因此这些亚家族被认为是主要候选者。因此，当定位于突触后膜的亚家族在神经元中过度表达时，PSD-95的棕榈酰化水平降低，并且其在突触后的积累显着减少。因此，为了鉴定位于突触后膜的三个亚家族成员中的主要基因，我们使用定量PCR对基因表达水平进行比较和定量。结果表明，一种基因在神经细胞中选择性表达。目前，我们正在创建缺乏去棕榈酰化候选基因的神经元，旨在阐明它们的生理意义。