グルタミン酸イメージングによるシナプス可塑性制御機構の時空間解析

使用谷氨酸成像对突触可塑性控制机制进行时空分析

• 批准号: 19890094
• 负责人: 並木 繁行
• 金额: $ 1.97万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19890094/
• 关键词: グルタミン酸; イメージング; シナプス

計画の1年目として、神経伝達物質であるグルタミン酸を可視化するための蛍光性のグルタミン酸可視化プローブ(EOS)の改良を行った。EOSはAMPA型グルタミン酸受容体のGluR2サブユニットのグルタミン酸結合ドメインを基本骨格として利用して、その403番目アミノ酸残基のセリンをシステインに置換し、そのシステインのチオール基に選択的に蛍光色素オレゴングリーンを結合させたものである。EOSを用いて、標本中のどこのシナプスがどの程度のグルタミン酸を放出しているのかを高精細に解析することを可能にし、ホルボールエステル等の薬物処理を行うことで生じるシナプスの可塑的変化を単一シナプスレベルの分解能で経時的に捉える事ができた。以上のグルタミン酸可視化プローブの開発からそのシナプス伝達可視化への応用の成果をまとめ、論文として発表した(Namiki S, Sakamoto H, Iinuma S, Iino M, Hirose K. European Journal of Neuroscience,25,2249)。EOSを用いてより高精細なグルタミン酸イメージングを実現する為に、従来型EOSにアミノ酸変異を加えることで、従来型と比べ約50%のダイナミックレンジの向上が実現した。これにより従来型では困難であった単一シナプスレベルでのグルタミン酸放出を培養海馬神経細胞において、優れたS/N比で検出することに成功した。また、高次構造データや過去の報告を基にグルタミン酸結合に寄与していると予想されるEOS中のアミノ酸残基に変異を導入しグルタミン酸との親和性の調節を試みた。これによりnMオーダーからmMオーダーの解離定数を有する複数のグルタミン酸プローブのラインナップの整備ができた。

作为程序的第一年，我们改进了荧光谷氨酸可视化探针（EOS），以可视化神经递质谷氨酸。 EOS使用AMPA型谷氨酸受体的GLUR2亚基的谷氨酸结合结构域作为基本主链，并在403rd氨基酸残基上用半胱氨酸取代丝氨酸，并选择性地将半胱氨酸的硫醇基团与荧光蛋白蛋白蛋白绿色结合。使用EOS，可以在高清样品中进行高清分析，在样品中突触在多大程度上释放出谷氨酸，并且可以通过单个突触液水平分辨率随时间捕获诸如Phorbol酯等药物处理时发生的塑性变化。将上述谷氨酸可视化探针从其应用到突触传播可视化的结果进行了总结并作为论文发表（Namiki S，Sakamoto H，Iinuma S，Iino M，Iino M，Hirose K. Hirose K.欧洲神经科学杂志，25，2249）。为了使用EOS实现高清谷氨酸成像，将氨基酸突变添加到常规EOS中，与常规类型相比，动态范围约为50％。这导致在单个突触水平上检测到谷氨酸释放，这在常规方法中很难，在培养的海马神经元中具有出色的信噪比。此外，基于高阶结构数据和过去的报告，将突变引入了EOS中的氨基酸残基中，这有望有助于谷氨酸结合，并试图调节与谷氨酸的亲和力。这允许开发具有从NM到MM阶的多个谷氨酸探针的阵容。

项目成果

Development of the high performance glutamate indicator for visualization of neurotransmission

开发用于神经传递可视化的高性能谷氨酸指示剂

• 发表时间: 2007
• 作者: Namiki S;Sakamoto H;Iinuma S;Iino M;Hirose K.;Okubo Y;linuma S;Nakanishi A
• 通讯作者: Nakanishi A

Imaging glutamate spillover from synaptic clefts using the fluorescent glutamate indicator

使用荧光谷氨酸指示剂对突触间隙的谷氨酸溢出进行成像

• 发表时间: 2007
• 作者: Namiki S;Sakamoto H;Iinuma S;Iino M;Hirose K.;Okubo Y
• 通讯作者: Okubo Y

Optical glutamate sensor for spatiotemporal analysis of synaptic transmission

• DOI: 10.1111/j.1460-9568.2007.05511.x
• 发表时间: 2007-04-01
• 期刊: EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE
• 影响因子: 3.4
• 作者: Namiki, Shigeyuki;Sakamoto, Hirokazu;Hirose, Kenzo
• 通讯作者: Hirose, Kenzo

Generation of novel fluorescent glutamate indicators by high-through put screening system

通过高通量筛选系统生成新型荧光谷氨酸指示剂

• 发表时间: 2007
• 作者: Namiki S;Sakamoto H;Iinuma S;Iino M;Hirose K.;Okubo Y;linuma S
• 通讯作者: linuma S