グルタミン酸イメージングによるシナプス可塑性制御機構の時空間解析

使用谷氨酸成像对突触可塑性控制机制进行时空分析

• 批准号: 19890094
• 负责人: 並木 繁行
• 金额: $ 1.97万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (Start-up)
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-19890094/
• 关键词: グルタミン酸; イメージング; シナプス

計画の1年目として、神経伝達物質であるグルタミン酸を可視化するための蛍光性のグルタミン酸可視化プローブ(EOS)の改良を行った。EOSはAMPA型グルタミン酸受容体のGluR2サブユニットのグルタミン酸結合ドメインを基本骨格として利用して、その403番目アミノ酸残基のセリンをシステインに置換し、そのシステインのチオール基に選択的に蛍光色素オレゴングリーンを結合させたものである。EOSを用いて、標本中のどこのシナプスがどの程度のグルタミン酸を放出しているのかを高精細に解析することを可能にし、ホルボールエステル等の薬物処理を行うことで生じるシナプスの可塑的変化を単一シナプスレベルの分解能で経時的に捉える事ができた。以上のグルタミン酸可視化プローブの開発からそのシナプス伝達可視化への応用の成果をまとめ、論文として発表した(Namiki S, Sakamoto H, Iinuma S, Iino M, Hirose K. European Journal of Neuroscience,25,2249)。EOSを用いてより高精細なグルタミン酸イメージングを実現する為に、従来型EOSにアミノ酸変異を加えることで、従来型と比べ約50%のダイナミックレンジの向上が実現した。これにより従来型では困難であった単一シナプスレベルでのグルタミン酸放出を培養海馬神経細胞において、優れたS/N比で検出することに成功した。また、高次構造データや過去の報告を基にグルタミン酸結合に寄与していると予想されるEOS中のアミノ酸残基に変異を導入しグルタミン酸との親和性の調節を試みた。これによりnMオーダーからmMオーダーの解離定数を有する複数のグルタミン酸プローブのラインナップの整備ができた。

在该项目的第一年，我们改进了荧光谷氨酸可视化探针（EOS）来可视化神经递质谷氨酸。 EOS以AMPA型谷氨酸受体GluR2亚基的谷氨酸结合域为基本骨架，将第403个氨基酸残基处的丝氨酸替换为半胱氨酸，并选择性地将荧光染料俄勒冈绿附着在半胱氨酸的硫醇基上。它是一个组合使用 EOS，可以高精度分析样本中的哪些突触释放了多少谷氨酸，以及用佛波酯等药物治疗时发生的突触塑性变化，我们能够随着时间的推移以一定的分辨率捕获这一变化。单个突触的。上述谷氨酸可视化探针的开发结果及其在突触传递可视化中的应用总结并发表在一篇论文中（Namiki S，Sakamoto H，Iinuma S，Iino M，Hirose K.European Journal of Neuroscience，25，第2249章）为了利用EOS实现更高清的谷氨酸成像，在传统EOS的基础上添加了氨基酸突变，与传统EOS相比，动态范围提高了约50%。结果，我们成功地检测了培养的海马神经元中单个突触水平的谷氨酸释放，并具有优异的信噪比，这是传统方法难以做到的。此外，根据高阶结构数据和过去的报告，我们尝试通过向 EOS 中预计有助于谷氨酸结合的氨基酸残基引入突变来调节对谷氨酸的亲和力。因此，我们能够制备一系列解离常数为 nM 至 mM 的多种谷氨酸探针。

项目成果

Development of the high performance glutamate indicator for visualization of neurotransmission

开发用于神经传递可视化的高性能谷氨酸指示剂

• 发表时间: 2007
• 作者: Namiki S;Sakamoto H;Iinuma S;Iino M;Hirose K.;Okubo Y;linuma S;Nakanishi A
• 通讯作者: Nakanishi A

Imaging glutamate spillover from synaptic clefts using the fluorescent glutamate indicator

使用荧光谷氨酸指示剂对突触间隙的谷氨酸溢出进行成像

• 发表时间: 2007
• 作者: Namiki S;Sakamoto H;Iinuma S;Iino M;Hirose K.;Okubo Y
• 通讯作者: Okubo Y

Optical glutamate sensor for spatiotemporal analysis of synaptic transmission

• DOI: 10.1111/j.1460-9568.2007.05511.x
• 发表时间: 2007-04-01
• 期刊: EUROPEAN JOURNAL OF NEUROSCIENCE
• 影响因子: 3.4
• 作者: Namiki, Shigeyuki;Sakamoto, Hirokazu;Hirose, Kenzo
• 通讯作者: Hirose, Kenzo

Generation of novel fluorescent glutamate indicators by high-through put screening system

通过高通量筛选系统生成新型荧光谷氨酸指示剂

• 发表时间: 2007
• 作者: Namiki S;Sakamoto H;Iinuma S;Iino M;Hirose K.;Okubo Y;linuma S
• 通讯作者: linuma S