微小管モーターとその変異体を用いた分子モーター作用機構の階層論的研究

使用微管马达及其突变体进行分子运动作用机制的分层研究

• 批准号: 10175218
• 负责人: 太和田 勝久
• 金额: $ 1.28万
• 依托单位: Kyushu University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10175218/
• 关键词: 分子モーター; キネシン; NCD; 変異体; 滑り運動; 活性化型ATPアーゼ; 非線形動力学解析

野性型の分子モータは,細胞骨格繊維と相互作用すると,そのATP分解が活性化され,繊維の一方向性の滑り運動を生じる。分子モータの或る変異体は,野性型分子モータと同様にATP分解は繊維によって活性化されるが,繊維の一方向性の滑り運動を起こすことができず,繊維の一次元的な「双方向性」のランダム運動を起こす。これらの変異体によって生じる繊維の一次元的ランダム運動を非線形動力学解析法などをもちいて詳細に解析することにより,野性型分子モータにあって,これらの変異体モータに欠けているメカニズムを見いだし,分子モータが活性化型ATP分解に共役して「一方向性」の滑り力を能動的に発生する仕組みの解明を目指すのが本研究の目的である。1. 上記の特徴を持つ変異体分子モータとして,微小管モータのひとつであるNCDの,柄部の短い変異体MC5を本研究で用いる。まずGST-MC5という融合タンパクを,大腸菌を用いて発現し,精製単離した。GST-MC5をin vitro滑り運動測定セル中のガラス面に固定して,そのセル中に微小管を加えると、GST-MC5のATP分解が活性化されることを確かめた。次に,GST-MC5をスロンビン処理することで,MC5を切り出したが,分子量的に少し異なる2種類の標本を得た。スロンビンが融合タンパクの異なる2か所を切断するからであることが判明した。2. そこで,単一分子量のMC5を調整するために大腸薗でMC5を直接発現することにした。そのために,現在,pGEX-MC5からPCRでMC5を取り出し,新しくpET-MC5を構築中である。外注したPCR用のプライマーに作成ミスが2度も有ったので、このMC5のベクターの構築が予想より遅れている。3. 実験的に観察されている8nm以下のキネシン・ステップサイズを説明する理論を作った。そして、その計算機実験で8nm以下のステップの生じることを示した。この結果は現在論文に執筆中である。

当野生型分子马达与细胞骨架纤维相互作用时，它们的 ATP 降解被激活，导致纤维的单向滑动。在分子马达的某种突变体中，ATP降解是由纤维激活的，与野生型分子马达一样，但它不能引起纤维的单向滑动运动；导致“热带”随机运动。通过使用非线性动力学分析方法详细分析这些突变体产生的纤维的一维随机运动，我们将发现野生型分子马达中存在但这些突变体马达中缺乏的机制。本研究的目的是。阐明分子马达通过与激活的 ATP 分解耦合主动产生“单向”滑动力的机制。 1. 在本研究中，我们使用微管马达之一的NCD的短柄突变体MC5作为具有上述特征的突变分子马达。首先，使用大肠杆菌表达并纯化和分离一种称为 GST-MC5 的融合蛋白。我们确认，当将 GST-MC5 固定在体外滑动测量细胞的玻璃表面上并将微管添加到细胞中时，GST-MC5 的 ATP 降解被激活。接下来，通过用凝血酶处理GST-MC5来切出MC5，获得分子量略有不同的两种样本。事实证明，这是因为凝血酶在两个不同的位置切割融合蛋白。 2.因此，我们决定直接在大肠中表达MC5，以制备单一分子量的MC5。为此，我们目前正在通过PCR从pGEX-MC5中提取MC5来构建新的pET-MC5。该 MC5 载体的构建速度比预期慢，因为外包的 PCR 引物制作了两次。 3. 我们发展了一种理论来解释实验观察到的驱动蛋白步长小于 8 nm。然后，计算机实验表明出现了8纳米或更小的台阶。目前，研究结果正在被写入论文中。