1分子蛍光イメージング法による生物分子モーターの連続歩行性能とステップの解析

利用单分子荧光成像方法分析生物分子运动的连续行走性能和步数

• 批准号: 10175221
• 负责人: 船津 高志
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Waseda University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research on Priority Areas (A)
• 财政年份: 1998
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1998 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-10175221/
• 关键词: 蛍光顕微鏡; 1分子イメージング; モータータンパク質; ダイニン

クラミドモナスの鞭毛軸糸には内腕に8種類、外腕に3種類のダイニン重鎖が存在することが知られている。多様な分子種の運動特性と鞭毛の屈曲運動との関連を明らかにするため、ダイニンの1分子蛍光運動アッセイ法の確立を試みた。対象として内腕の単頭ダイニンCに注目し、連続歩行性能(processivility)の直接検定と、微小管と相互作用して力を出している時間の割合(duty ratio)の直接測定を行った。まず、ダイニンCに蛍光色素テトラメチルローダミンを1対1の割合で結合させ、蛍光色素Cy5で標識した微小管と相互作用させた。蛍光色素による修飾がダイニンの運動活性に影響を与えないことを、通常のグライディングアッセイ法(ダイニンをガラス基板に吸着させて微小管の運動を観察する方法)で確認した。ダイニン分子の密度が充分に高い場合、微小管は8μm/sで滑り運動した。1分子のダイニンが相互作用する低密度(1個/μm^2)ではピボッティング運動が観察されるようになり、滑り速度も0.7μm/sに減少した。次に、微小管をガラスに吸着させ、蛍光標識したダイニンCとATPを加えて1分子蛍光観察したところ、1分子(または2分子)のダイニンCが微小管を滑り運動する様子を捉えることに成功した。滑り速度は0.9μm/sであり、グライディングアッセイの結果と良く一致していた。ダイニン1分子の滑り速度が最大速度の11%にとどまっていることは、キネシンの場合は密度によらず滑り速度が一定であるのと対照的である。これは、ダイニンのduty ratioが僅か11%であるとすると説明がつく。

已知衣藻的鞭毛轴丝内臂有八种类型的动力蛋白重链，外臂有三种类型的动力蛋白重链。为了阐明不同分子种类的运动特征与鞭毛弯曲运动之间的关系，我们尝试建立动力蛋白的单分子荧光运动测定方法。针对内臂的单头动力蛋白C，我们对其连续行走性能（加工性）进行了直接测试，并直接测量了其与微管相互作用和施加力的时间比例（占空比）。首先，荧光染料四甲基罗丹明以一对一的比例与动力蛋白 C 结合，并与荧光染料 Cy5 标记的微管相互作用。我们使用传统的滑动测定方法（将动力蛋白吸附到玻璃基板上并观察微管运动的方法）确认荧光染料的修饰不会影响动力蛋白的运动活性。当动力蛋白分子的密度足够高时，微管以 8 μm/s 的速度滑动。在低密度（1 动力蛋白/μm^2）下，一个动力蛋白分子相互作用，观察到旋转运动，滑动速度降至 0.7μm/s。接下来，将微管吸附到玻璃上，添加荧光标记的动力蛋白C和ATP，进行单分子荧光观察，结果检测到微管上的一分子（或两分子）动力蛋白C的运动成功。滑动速度为0.9μm/s，与滑动测定的结果非常吻合。一个动力蛋白分子的滑动速度仅为最大速度的 11%，而驱动蛋白则无论密度如何都具有恒定的滑动速度。如果 Dynein 的占空比仅为 11%，就可以解释这一点。