口腔内連鎖球菌の産生する骨芽細胞障害因子の精製とその病原性に関する研究

口腔链球菌产生的成骨细胞损伤因子的纯化及其致病性研究

• 批准号: 08672149
• 负责人: 佐藤 研一
• 金额: $ 1.41万
• 依托单位: Chiba University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (C)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08672149/
• 关键词: Streptococcus mitis; 慢性下顎骨骨髄炎; 骨芽細胞; cytotoxic

慢性下顎骨骨髄炎の起因菌であるStreptococcus-mitis-JK09株の病原因子を検討したところ、菌体破砕物(以下、lysate)中にラット骨肉腫由来培養骨芽細胞C5.8Hの形態変化を引き起こし、細胞障害を起こす活性(以下、障害活性)が存在することを見いだし、この活性を担う物質(以下、TOX)の性状を検討すると共に、その精製を試みた。障害活性は60℃30分の加熱処理、及びトリプシン処理で失活することより、TOXは易熱性のタンパクであることがわかった。限外濾過膜の通過性から推定したTOXの分子量は100,000以上であった。粗製製標品(lysate)中のTOXは4℃においても容易に失活し、障害活性を安定に保つためには4mM以上の濃度のEDTAによって蛋白分解酵素を不活化することが重要であることがわかった。また、TOXは共存する他の蛋白質との凝集傾向が示唆されたため1M尿素存在下でその精製方法を検討したところ、硫酸アンモニウムによる塩析法、陰イオン交換樹脂(DEAE-Sephacel)、疎水性樹脂(Phenyl-Sepharose)、ハイドロキシアパタイトゲル、ゲル濾過樹脂によって効率的に共存蛋白と分離できることがわかり、これらの方法を組み合わせることでTOXが精製できると期待している。尚、ゲル濾過法により推定したTOX分子量は約150,000であった。C5.8H細胞はTOXの作用後約18時間で細胞の偏平化、萎縮が認められ、TOXがcytotoxicな作用を有していることが示唆された。口腔内より分離した別のS.mitis菌株について同様の障害活性を検討したところ、障害活性の認められない菌株が存在することより、TOXがこの症例にみる症状の発現に何らかの役割を担っていた可能性が示唆された。

当我们对慢性下颌骨骨髓炎的病原体Streptococcus-mitis-JK09菌株的致病因素进行调查时，我们发现在大鼠骨肉瘤来源的培养成骨细胞C5.8H的细菌细胞碎片（以下简称为C5.8H）中观察到形态变化。我们发现其具有导致细胞损伤的活性（以下简称“毒性活性”），并研究了导致该活性的物质（以下简称TOX）的性质并尝试将其纯化。 60°C 热处理 30 分钟和胰蛋白酶处理可使其破坏活性失活，表明 TOX 是一种热不稳定蛋白。通过超滤膜的渗透性估算出TOX的分子量超过100,000。粗制品（裂解物）中的 TOX 即使在 4℃ 下也很容易失活，因此我理解，用 4mM 或更高浓度的 EDTA 失活蛋白酶很重要，以保持破坏活性稳定。此外，由于有人认为 TOX 有与其他共存蛋白质聚集的倾向，因此我们研究了在 1M 尿素存在下的纯化方法。我们发现使用苯基琼脂糖、羟基磷灰石凝胶、羟基磷灰石凝胶可以有效分离共存蛋白质。和凝胶过滤树脂，我们期望通过结合这些方法可以纯化 TOX。通过凝胶过滤法估算的TOX分子量约为150,000。 TOX作用后约18小时，在C5.8H细胞中观察到细胞变平和萎缩，表明TOX具有细胞毒作用。当我们检查从口腔中分离出的其他 S.mitis 菌株的类似破坏活性时，有些菌株没有表现出破坏活性，这表明 TOX 在本例中所见症状的表现中发挥了一定作用。