腫瘍マーカー・グルタチオントランスフェラーゼPの発現に関わる転写因子の単離と解析

肿瘤标志物谷胱甘肽转移酶P表达相关转录因子的分离与分析

• 批准号: 08457056
• 负责人: 久武 幸司
• 金额: $ 4.22万
• 依托单位: Saitama Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Scientific Research (B)
• 财政年份: 1996
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 1996 至 无数据
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-08457056/
• 关键词: 肝癌; GST-P; 転写因子; maf

われわれは、GPEIに結合する因子の解析を行い、肝癌細胞AH66と正常肝で比較検討したところ複数の因子がGPEIに結合することを見いだした。フットプリント法の結果より、1)GPEIのTRE-like配列に結合する因子、2)GPEIのTRE-like配列の20-50bp上流に結合する複数の因子を同定した。1)の因子は肝癌と正常肝でフットプリント上では差が認められないが、2)の因子は両者の間でフットプリント上で明らかな差が認められる。1)の因子はさらにDEAE-Sepharoseに結合するもの(C1)とそうでないもの(C2)に分かれる。これらの結果、GPEIに結合する因子は少なくとも4種類はあることが明らかとなった。1)の因子(C1及びC2)をDEAE-Sepharoseによって分画後、さらに二つのカラムで部分精製し、それらのDNA結合能をゲルシフト法及びフットプリント法で検討した。また、それぞれの分画をc-jun及びmafの抗体を用いたimmunoblotにて検討した。フットプリント法を用いた結合実験で、C1、C2共にGST-Pの転写に重要なcore GPEIの領域に結合することが分かった。又、ゲルシフト法及びフットプリント法で競合実験を行った結果、両因子共にcore GPEIのG→Tの点突然変異によって結合が著しく低下し、GPEI変異体の転写活性とC1、C2に対する結合活性とは特異性が一致することが分かった。さらにimmunoblotの結果、C1にはc-jun、maf共に検出されなかったが、C2にはc-junが検出された。また、C2にはmafの抗体と反応する55kDaのタンパク質が検出され、分子量より、新しいmafファミリーのタンパク質と考えられる。部分分画した再構成in vitro転写系で両因子の転写活性の検出を試みたが、GTS-Pプロモーターの活性が低いため未だ明確な結果は得られていない。以上より、C1、C2共にGST-Pの転写活性化に関与している可能性が大きく、それぞれの因子をさらに精製し、それらのcDNAを単離する予定である。

我们分析了与GPEI结合的因素，并在AH66肝癌细胞和正常肝脏之间进行比较，发现多种因素与GPEI结合。根据足迹法的结果，我们确定了1）与GPEI的TRE样序列结合的因子，以及2）与GPEI的TRE样序列上游20-50 bp结合的多个因子。肝癌和正常肝脏之间因子 1) 的足迹没有差异，但两者之间因子 2) 的足迹存在明显差异。因子 1) 进一步分为与 DEAE-Sepharose 结合的因子 (C1) 和不与 DEAE-Sepharose 结合的因子 (C2)。这些结果表明至少有四种类型的因子与 GPEI 结合。使用DEAE-Sepharose对因子1)（C1和C2）进行分级，然后使用两根柱进行部分纯化，并使用凝胶位移法和足迹法检查它们的DNA结合能力。此外，使用 c-jun 和 maf 抗体通过免疫印迹检查每个级分。使用足迹法的结合实验表明，C1 和 C2 均与核心 GPEI 区域结合，这对于 GST-P 转录很重要。此外，使用凝胶位移法和足迹法的竞争实验结果表明，核心GPEI的G→T点突变显着降低了两个因子的结合，并且核心GPEI的C1和C2的转录活性和结合活性显着降低。发现 GPEI 突变体的特异性显着降低。此外，免疫印迹的结果，在C1中未检测到c-jun和maf，但在C2中检测到c-jun。此外，在C2中检测到了与maf抗体反应的55kDa蛋白，根据其分子量，认为它是一种新的maf家族蛋白。我们尝试使用部分分级重组的体外转录系统来检测这两个因子的转录活性，但由于GTS-P启动子的活性较低，尚未获得明确的结果。由此可见，C1和C2极有可能都参与GST-P转录激活，我们计划进一步纯化各因子并分离其cDNA。