細胞質ダイニンが微小管上を「小股歩き」をする機構の解明

阐明细胞质动力蛋白在微管上“行走”的机制

基本信息

批准号：
07J09333
负责人：
島知弘
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞質ダイニンは、モーター活性を担う重鎖が二量体を形成して働いている。昨年度、私は別々に精製した単量体重鎖2つを二量体化させることに成功し、これによって二つの重鎖間の制御の実態を研究することが可能になった。本年度私は、まず一方の重鎖をATPと結合できずモーター活性のない、いわゆる「死んだ」変異体(P1T変異体)に代えたヘテロ二量体を作成した。P1T変異体はそれ自身では微小管から解離せず動かないはずであるが、このヘテロ二量体は1分子で微小管上を長距離運動した。この挙動はキネシンなどでは報告されておらず、ダイニン特有のものである。P1T変異体はATPと結合しないため、ATP加水分解に伴う力発生が起こらない。つまりこの結果は、細胞質ダイニンのプロセッシブな歩行には、片方の重鎖のATP加水分解過程の進行や力発生が不要であることを示している。一方の重鎖の力発生なしで二足歩行するという現象は、2つの重鎖が交互に力発生を繰り返して進むという従来型のモデルでは説明できないので、この野生型/P1Tヘテロ二量体ダイニンの運動様式を詳細かつ定量的に調べることで、分子モーターの新たな動作機構を発見することができるかもしれない。したがって今後は、光ピンセットやFIONAを用いて、野生型/P1Tヘテロ二量体ダイニンが微小管上をステップする様子を計測することで、野生型およびP1T変異体各重鎖のステップサイズ・Dwell time・力などを明らかにすることが必要とされる。またP1T変異体はそれ自身では、微小管から解離しないにもかかわらず、野生型とのヘテロ二量体になるとプロセッシブに動くことができるということから、二つの重鎖の間に機械的な張力がかかっており、片方の重鎖がもう一方の重鎖を微小管から引き離すような仕組みが存在していることが示唆される。この機械的な張力の伝達部位としては、二つのダイニン重鎖が結合している尾部末端が最も可能性が高いと考えられたが、尾部末端に柔軟なリンカーを挿入し、尾部末端を介した張力が伝わらないよう設計した二量体組換えダイニンが、リンカーを挿入していないものと同様にプロセッシブに運動することが確認された。この結果は、ダイニン重鎖の尾部末端以外の領域に、機械的な張力を伝達できる程度の強い重鎖間相互作用を示す部位が存在することを示唆している。今後は、新たなダイニン重鎖相互作用部位を同定することによって、細胞質ダイニンのプロセッシブな運動を達成させている重鎖間の制御の実態を解明できるものと期待される。

细胞质动力蛋白是一条负责形成二聚体的运动活动的重链。去年，我成功地将两个单独的纯化单体质量链弄了，这使研究两个重链之间的实际调节成为可能。今年，我首先创建了一个异二聚体，该异二聚体用所谓的“死”突变体（P1T突变体）取代了一个重链，该链无法与ATP结合并且没有运动活动。 P1T突变体本身不应与微管分离并从微管中移动，但是该异二聚体用一个分子在微管上移动长距离。这种行为尚未在运动蛋白或类似中报道，并且是动力蛋白所独有的。由于P1T突变体不与ATP结合，因此ATP水解不会发生力发育。该结果表明，一个重链的ATP水解过程和胞质动力蛋白的加工不是必需的。传统模型未通过一个重链交替产生力来解释两足动力的现象，而没有一个重链产生强链，因此，通过详细研究野生型/P1T异二二聚体动力蛋白的这种运动方式，并可能是定量的，可以发现分子运动的运动机制。因此，有必要使用光学镊子和Fiona来确定野生型和P1T突变体每个重链的步长，停留时间和力。此外，尽管P1T突变体本身并不能与微管分离，但是当它成为具有野生型的异二聚体时，可以进行过程移动，这表明有一个重链将另一个重链与微管分离的机制。人们认为，机械张力转移的最有可能的部位是在尾部附着的，但可以证实，旨在在尾部插入柔性链接器并防止尾部通过尾部插入张力的二聚体重组动力蛋白将在尾部进行，类似于类似于非插入的处理器。该结果表明，在表现出强烈的链间相互作用的区域中存在除尾部末端以外的区域，这些区域能够传递机械张力。预计将来，通过识别新的动力蛋白重链相互作用位点，我们将能够阐明重链之间的实际调节状态，这可以实现细胞质动力蛋白的加工运动。