細胞質ダイニンが微小管上を「小股歩き」をする機構の解明

阐明细胞质动力蛋白在微管上“行走”的机制

基本信息

批准号：
07J09333
负责人：
島知弘
金额：
$ 1.15万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

細胞質ダイニンは、モーター活性を担う重鎖が二量体を形成して働いている。昨年度、私は別々に精製した単量体重鎖2つを二量体化させることに成功し、これによって二つの重鎖間の制御の実態を研究することが可能になった。本年度私は、まず一方の重鎖をATPと結合できずモーター活性のない、いわゆる「死んだ」変異体(P1T変異体)に代えたヘテロ二量体を作成した。P1T変異体はそれ自身では微小管から解離せず動かないはずであるが、このヘテロ二量体は1分子で微小管上を長距離運動した。この挙動はキネシンなどでは報告されておらず、ダイニン特有のものである。P1T変異体はATPと結合しないため、ATP加水分解に伴う力発生が起こらない。つまりこの結果は、細胞質ダイニンのプロセッシブな歩行には、片方の重鎖のATP加水分解過程の進行や力発生が不要であることを示している。一方の重鎖の力発生なしで二足歩行するという現象は、2つの重鎖が交互に力発生を繰り返して進むという従来型のモデルでは説明できないので、この野生型/P1Tヘテロ二量体ダイニンの運動様式を詳細かつ定量的に調べることで、分子モーターの新たな動作機構を発見することができるかもしれない。したがって今後は、光ピンセットやFIONAを用いて、野生型/P1Tヘテロ二量体ダイニンが微小管上をステップする様子を計測することで、野生型およびP1T変異体各重鎖のステップサイズ・Dwell time・力などを明らかにすることが必要とされる。またP1T変異体はそれ自身では、微小管から解離しないにもかかわらず、野生型とのヘテロ二量体になるとプロセッシブに動くことができるということから、二つの重鎖の間に機械的な張力がかかっており、片方の重鎖がもう一方の重鎖を微小管から引き離すような仕組みが存在していることが示唆される。この機械的な張力の伝達部位としては、二つのダイニン重鎖が結合している尾部末端が最も可能性が高いと考えられたが、尾部末端に柔軟なリンカーを挿入し、尾部末端を介した張力が伝わらないよう設計した二量体組換えダイニンが、リンカーを挿入していないものと同様にプロセッシブに運動することが確認された。この結果は、ダイニン重鎖の尾部末端以外の領域に、機械的な張力を伝達できる程度の強い重鎖間相互作用を示す部位が存在することを示唆している。今後は、新たなダイニン重鎖相互作用部位を同定することによって、細胞質ダイニンのプロセッシブな運動を達成させている重鎖間の制御の実態を解明できるものと期待される。

细胞质动力蛋白通过形成负责运动活动的重链二聚体来发挥作用。去年，我成功地将两条单独纯化的单体重链二聚化，这使得研究两条重链之间的实际调控状态成为可能。今年，我首次创建了一种异二聚体，其中一条重链被所谓的“死亡”突变体（P1T 突变体）取代，该突变体无法结合 ATP，也没有运动活性。尽管 P1T 突变体本身不会与微管分离并且不应移动，但这种异二聚体的单个分子在微管上移动了很长的距离。尚未报道驱动蛋白的这种行为，并且是动力蛋白所独有的。由于 P1T 突变体不结合 ATP，因此不会发生与 ATP 水解相关的力产生。换句话说，这一结果表明细胞质动力蛋白的持续行走不需要重链之一的ATP水解过程或力的产生。没有一条重链产生力的双足运动现象无法用两条重链交替产生力的常规模型来解释，因此野生型/P1T异二聚动力蛋白通过详细和定量地研究分子的运动模式，或许有可能发现分子马达的新运行机制。因此，今后我们将利用光镊和FIONA来测量野生型/P1T异二聚动力蛋白在微管上的步长，从而确定野生型和P1T突变体各重链的步长和停留时间。有必要澄清权力等。此外，虽然P1T突变体本身不会与微管解离，但当它与野生型形成异二聚体时，它可以进行性移动，这表明两条重链之间产生了机械张力，这表明存在一种机制。其中一条重链将另一条重链拉离微管。最有可能传递这种机械张力的位点是尾端，即两条动力蛋白重链连接的地方，但我们在尾端插入了一个柔性接头，并通过尾端传递了机械张力，结果证实了二聚体重组体。动力蛋白被设计为不传递张力，其连续移动方式与未插入连接体的动力蛋白相同。这一结果表明，除了动力蛋白重链尾端之外，还存在一个区域表现出强烈的重链间相互作用，能够传递机械张力。未来，预计通过识别新的动力蛋白重链相互作用位点，我们将能够阐明重链之间控制实现细胞质动力蛋白持续运动的现实。