脊椎動物の季節性測時機構の解明

阐明脊椎动物的季节计时机制

基本信息

批准号：
07J08345
负责人：
中尾暢宏
金额：
$ 1.41万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

光周性の制御機構には、下垂体隆起葉で時刻依存的に光誘導を受け発現するTSHBがマスターコントロール遺伝子として働いている(Nakao et al.Nature,2008,452,317-322)。しかし、TSHBと同時期に発現するEYES ABSENT 3(EYA3)の光周性における役割、およびTSHB,EYA3の時刻依存的な光誘導発現調節機構は不明であり、これらを解明することは光周性の全貌の解明に繋がると考えられる。そこで、本年度の研究実施計画に示したように計画1.EYA3のターゲット遺伝子の同定、計画2.光周時計と臨界日長の関係を解明することを目標とした。計画1では、EYA3が転写共役因子であることから、免疫染色法により下垂体隆起葉におけるEYA3の時刻依存的な細胞内局在を明らかにし、EYA3が転写制御に関わる時間帯を決定した。この時間帯におけるウズラ下垂体隆起葉とウズラEYA3抗体を用いたChIP-sequenceにより104遺伝子の候補遺伝子を抽出することができた。今後、これらの遺伝子とEYA3の相互作用を解析する必要かおる。計画2では、光周時計候補遺伝子は、約77遺伝子が存在する。これらの発現部位を検討した結果、下垂体隆起葉では14遺伝子と概日時計の構成因子である時計遺伝子が発現していた。次にウズラTSHBおよびEYA3遺伝子の転写調節領域を含む約40kbpの核酸配列を決定し、転写因子結合領域を検索した。ルシフェラーゼアッセイによりシスエレメントの機能性を検討したところ、両遺伝子ともに転写活性を示したが、そのシグナル伝達経路は異なる可能性を示唆する結果が得られた。

在光周期控制机制中，TSHB在光诱导下以时间依赖性方式在垂体叶中表达，充当主控基因(Nakao et al. Nature, 2008, 452, 317-322)。然而，与TSHB同时表达的EYES ABSENT 3（EYA3）在光周期中的作用以及TSHB和EYA3的时间依赖性光诱导表达调节机制尚不清楚，并且很难阐明这些。认为这将导致整个画面的阐明。因此，正如今年的研究实施计划所示，我们设定了计划一：确定EYA3靶基因和计划二：阐明光周期钟与临界光周期关系的目标。在方案1中，由于EYA3是转录辅助因子，我们利用免疫染色阐明EYA3在垂体叶中的时间依赖性亚细胞定位，并确定EYA3参与转录调节的时间段。在此期间，我们使用鹌鹑垂体隆起叶和鹌鹑 EYA3 抗体通过 ChIP 测序提取了 104 个候选基因。未来有必要分析这些基因与EYA3之间的相互作用。在计划2中，光周期时钟大约有77个候选基因。检查这些表达位点的结果是，作为生物钟组成因素的14个基因和时钟基因在垂体叶中表达。接下来，我们确定了包含鹌鹑TSHB和EYA3基因转录调控区的约40 kbp的核酸序列，并寻找转录因子结合区。当使用荧光素酶测定研究顺式元件的功能时，两个基因均显示转录活性，但结果表明它们的信号转导途径可能不同。