ポストゲノム時代の挑戦:ABCG2タンパク質の品質管理と小胞体ストレス

后基因组时代的挑战：ABCG2蛋白质量控制和内质网应激

• 批准号: 07J05897
• 负责人: 中尾 香菜子 (若林 香菜子)
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J05897/
• 关键词: 多剤耐性; ABCトランスポーター; ABCG2; 小胞体ストレス; ユビキチン化; タンパク質品質管理機構

本研究ではガン細胞における多剤耐性の要因として注目されてきたABCG2を膜タンパク質のモデルとして、糖鎖付加、ジスルフィド結合、ユビキチン化に代表される翻訳後修飾とタンパク質の品質管理、細胞内安定性との関係を解明しそれを制御する分子プローブを設計することを目的としている。最終年度となる本年は以下の2点に焦点をあてた。(1)ABCG2タンパク質の品質管理と分解経路機構ABCG2タンパク質の第3番目の細胞外ループに存在する2つのCys残基(Cys592,Cys608)は、ABCG2のタンパク質としての安定性を維持する上で重要である。それらのCys残基が欠損すると、分子内S-S結合が形成されず、タンパク質としての構造が不安定化し、未成熟タンパク質としてユビキチン・プロテアソーム系で分解されてしまう。また実際ヒトからみつかっている2つの一塩基多型(F208S,S441N)でも前述の変異体と同様のメカニズムで分解されるため、発現量減少を引き起こすことも明らかとなった。そこでさらなる検証を行うため、電子顕微鏡法により、細胞内の状態の観察を行った。その結果、プロテアソーム阻害剤MG132処理を行った変異型ABCG2発現細胞では、細胞内にアグリソームと呼ばれる凝集体を観察することができた。さらにABCG2特異的な抗体を用いて、免疫電子顕微鏡法による観察を行ったところ、アグリソーム内にABCG2陽性反応が確認された。(2)イオントラップ型質量分析器を用いたプロテオーム解析ABCG2は小胞体内で様々なシャペロンタンパク質の助けを借りてS-S結合形成や糖鎖付加が起こり、高次構造が形成される。また未成熟タンパク質として分解されるか、成熟タンパク質としてゴルジ体へと輸送されるかの選別も小胞体で受けており、その選別にもシャペロンタンパク質が関与しているようである。そこで、イオントラップ型質量分析器を用い、ABCG2と相互作用するシャペロンタンパク質の探索を行った。変異型ABCG2として、S-S結合や糖鎖を欠損する変異体および発現量が減少する一塩基多型を用いている。その結果、変異型に特異的に結合しているシャペロンタンパク質がいくつか検出された。

在这项研究中，ABCG2作为癌细胞多药耐药性的一个因素而受到关注，被用作模型膜蛋白来研究翻译后修饰，如糖基化、二硫键和泛素化、蛋白质质量控​​制和细胞内稳定性目的是阐明两者之间的关系并设计分子探针来控制它。今年是最后一年，我们重点抓了以下两点。 (1)ABCG2蛋白的质量控制和降解途径机制ABCG2蛋白的第三胞外环中存在的两个C​​ys残基(Cys592、Cys608)对于维持ABCG2作为蛋白的稳定性是重要的。当这些Cys残基被删除时，分子内S-S键不形成，蛋白质结构变得不稳定，蛋白质被泛素蛋白酶体系统降解为不成熟蛋白质。还发现，实际上在人类中发现的两个单核苷酸多态性（F208S、S441N）通过与上述突变体相同的机制被降解，导致表达水平降低。因此，为了进行进一步验证，使用电子显微镜观察细胞内状态。结果，在用蛋白酶体抑制剂 MG132 处理的表达突变 ABCG2 的细胞中，可以在细胞内观察到称为聚集体的聚集体。此外，当使用ABCG2特异性抗体进行免疫电子显微镜检查时，在聚集体内确认了阳性ABCG2反应。 (2)使用离子阱质谱仪进行蛋白质组分析 ABCG2在内质网内借助各种伴侣蛋白进行S-S键形成和糖基化，形成高阶结构。内质网还选择蛋白质是被降解为不成熟蛋白质还是作为成熟蛋白质运输到高尔基体，伴侣蛋白似乎也参与了这种选择。因此，我们使用离子阱质谱仪来寻找与ABCG2相互作用的伴侣蛋白。作为突变体ABCG2，我们使用缺乏S-S键和糖链以及降低表达水平的单核苷酸多态性的突变体。结果，检测到几种与突变型特异性结合的伴侣蛋白。

项目成果

Disulfide bond formation plays a crucial role in protein stability of human ABCG2

二硫键的形成在人ABCG2的蛋白质稳定性中起着至关重要的作用

• 发表时间: 2007
• 作者: Komada;M.;寺田 信生;花房洋;佐藤裕介;佐藤裕介;花房洋;遠藤彬則;遠藤彬則;駒田雅之;駒田雅之;向井明子;駒田雅之;駒田 雅之;遠藤 彬則;若林 香菜子
• 通讯作者: 若林 香菜子

The impacts of posttranslational modifications and non-synonymous SNPs on the protein stability of human ABC transporter ABCG2 protein in culture cells

翻译后修饰和非同义 SNP 对培养细胞中人 ABC 转运蛋白 ABCG2 蛋白稳定性的影响

• 发表时间: 2010
• 作者: Hiroshi Nakagawa;Kanako Wakabayashi-Nakao;Ai Tamura;Yu Toyoda;Shoko Koshiba;Tomoka Furukawa;Toshihisa Ishikawa
• 通讯作者: Toshihisa Ishikawa

Ubiquitin-mediated proteasomal degradation of non-synonymous SNP variants of human ABC transporter ABCG2

• DOI: 10.1042/bj20071229
• 发表时间: 2008-05-01
• 期刊: BIOCHEMICAL JOURNAL
• 影响因子: 4.1
• 作者: Nakagawa, Hiroshi;Tamura, Ai;Ishikawa, Toshihisa
• 通讯作者: Ishikawa, Toshihisa

lntramolecular disulfide bond is a critical checkpoint determining degradative fates of ABC transporter ABCG2 protein

分子内二硫键是决定ABC转运蛋白ABCG2蛋白降解命运的关键检查点

• 发表时间: 2007
• 期刊: J.Biol.Chem. 282(38)
• 作者: Wakabayashi K;Nakagawa H;Tamura A;Koshiba S;Hoshijima K;Komada M;Ishikawa T.
• 通讯作者: Ishikawa T.

Genetic polymorphisms of human ABCG2 and ER-associated degradation(ERAD)pathway

人类ABCG2基因多态性与ER相关降解(ERAD)途径

• 发表时间: 2008
• 作者: Wakabayashi K;Tamura A;An R;Hoshijima K;Nakagawa H;Ishikawa T.
• 通讯作者: Ishikawa T.