植物ウイルスベクターによる内在性遺伝子の転写抑制系の確立に向けた基盤研究

旨在利用植物病毒载体建立内源基因转录抑制系统的基础研究

基本信息

批准号：
07J03243
负责人：
太田垣駿吾
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Hokkaido University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、遺伝子導入以外の方法で遺伝子の発現を特異的に改変可能な育種法を開発するため、Cucumber mosaic virus(以下、CMV)に由来するウイルスベクターを用い、標的遺伝子に対して特異的に転写抑制型ジーンサイレンシング(Transcriptional Gene Silencing ; TGS)を誘導する系の開発を行っている。申請者はこれまで、カリフラワーモザイクウイルス35Sプロモーターの転写制御下でGFPを発現しているNicotiana benthamiana形質転換体に対して、35Sプロモーター配列を組み込んだベクターをゲノムの構成要素として持つキュウリモザイクウイルス(CMV)を2本鎖RNAの供給源として感染させることで、RdDMによるGFP遺伝子のTGSが誘導される系を確立している。さらに、TGS誘導個体から得た自殖第1世代(S1植物体)を解析したところ、接種時にCMVベクターに挿入した35Sプロモーター配列の部位により、TGSの維持効率が大きく異なる場合があることを見出した。そこで本年度は、S1植物体においてDNAのメチル化およびTGSが維持されていた個体をさらに自殖させることで自殖第2および第3世代(S2およびS3植物体)を得、それらの個体におけるDNAのメチル化およびGFP遺伝子のTGSの維持の有無を解析した。その結果、S2およびS3個体ではCMVベクターに挿入した配列の違いに関わらず、S1植物体で見られたGFP遺伝子の発現抑制が安定して維持されていた。さらにS2植物では、転写因子結合配列の一つであるAs-1領域を中心に高頻度のDNAのメチル化が検出された。以上より、CMVベクターを介して誘導されたゲノム中に挿入された35Sプロモーター領域のメチル化及びGFP遺伝子のTGSは2度の自殖を経ても安定して維持されることが明らかになった。

In this study, in order to develop breeding methods that allow specific modification of gene expression using methods other than gene transfer, we have developed a system that specifically induces transcriptional gene silencing (TGS) using a viral vector derived from Cucumber mosaic virus (hereinafter referred to as CMV) to specifically induce transcriptional repressive gene silencing (TGS) for target genes. The applicant has previously established a system in which the TGS of the GFP gene by RdDM is infected with Nicotiana benthamiana transformants, which express GFP under the transcriptional control of the cauliflower mosaic virus 35S promoter, with cucumber mosaic virus (CMV), which carries a vector containing the 35S promoter sequence as a genome component, as a source of双链RNA。此外，当分析从TGS诱导的个体获得的第一代自增殖（S1植物）时，发现TGS的维持效率可能会显着差异，这取决于接种时插入CMV载体的35S启动子序列的位置。因此，今年，我们进一步传播了其在S1植物中维持DNA甲基化和TG的个体，从而导致第二和第三代（S2和S3植物）的自我增殖，并分析了这些个体中的DNA甲基化以及GFP基因中的TGS是否维持。结果，无论插入CMV载体中的序列如何，在S2和S3个体中看到S1植物中看到的GFP基因表达的抑制。此外，在S2植物中，主要在AS-1区域中检测到高频DNA甲基化，这是转录因子结合序列之一。从上面可以揭示出，即使在两个自我增殖后，也能够稳定地维持了通过CMV载体和GFP基因的TGS诱导的基因组中的35S启动子区域的甲基化。