核外輸送因子exportin-5によるmicroRNA品質管理構造的基盤

核输出因子exportin-5控制microRNA质量的结构基础

• 批准号: 07J02896
• 负责人: 佐々木 浩
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: The University of Tokyo
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2007
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2007 至 2009
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J02896/
• 关键词: 構造生物学; microRNA; 核細胞質間輸送; 核外輸送因子

これまでの研究により,大腸菌組み換えタンパク質として発現させたヒトexportin-5は凝集体を形成しやすいこと,また当研究室で作製したシャペロン・マイナーtRNA共発現系を利用することで発現・可溶化を改善できることが分かっていた.しかし,依然として可溶化率が低く,結晶化に十分な量のタンパク質を調製することができないという問題があったため,この問題の解決に取り組んだ.培養条件・精製条件を詳細に検討したところ,可溶化率が向上する条件を発見することができた.また,当研究室で開発された大腸菌由来無細胞生物発現系によるヒトexportin-5の発現を試みた.通常の大腸菌由来無細胞生物発現系では真核生物由来タンパク質の発現は困難な場合が多い.これはシャペロン系が異なるというだけでなく,そもそも無細胞生物発現系内でmRNAの半減期が短く,十分な量の翻訳産物が産生されにくいことも原因である.大腸菌抽出液調製法を検討することで,mRNA分解活性を抑え,これまでと比べて翻訳産物の収量を大幅に改善した無細胞生物発現系の構築に成功した.現在,無細胞生物発現系を利用したexportin-5, Ran, pre-miRNAの複合体形成を試みている.

先前的研究表明，以重组大肠杆菌蛋白表示的人类Exportin-5很容易被聚集，并且可以通过利用我们实验室中产生的伴侣辅助蛋白辅助型TRNA共表达系统来改善表达和溶解化。但是，问题在于溶解速率仍然很低，无法用足够量的结晶制备蛋白质，因此我们致力于解决这个问题。经过详细研究培养和纯化条件后，我们发现了改善溶解率的条件。此外，大肠杆菌是在我们的实验室中开发的。我们尝试使用无细胞的生物表达系统来表达人类导出5。在正常的无细胞生物学表达系统中，真核蛋白的表达通常很难。这不仅是因为伴侣系统不同，还因为无细胞生物表达系统中mRNA的半衰期很短，而且很难生产足够的翻译产物。通过检查制备大肠杆菌提取物的方法，我们成功地构建了一个无细胞的生物表达系统，该系统抑制了mRNA降解活性，并显着提高了与上一位相比的翻译产物的产量。当前，使用无细胞生物表达系统的Exportin-5现已使用。跑步，试图形成一个前miRNA的复合物。

项目成果

大学院生による科学者コミュニケーションの可能性と課題:東大院生有志グループOto1の実践を通して

研究生科学家交流的可能性与挑战：通过东京大学研究生志愿者团体Oto1的实践

• 发表时间: 2009
• 期刊: Japanese Journal of Science Communication 6
• 作者: 小寺千絵;池内桃子;岩崎渉;榎戸輝揚;生出秀行;音野瑛俊;佐々木浩;砂田麻里子;手塚真樹;豊田丈典;永村直佳;浜地貴志;平沢達矢;松尾信一郎;宮武広直;横山広美
• 通讯作者: 横山広美

古細菌/真核生物型フェニルアラニルtRNA合成酵素の校正機構

古菌/真核苯丙氨酰-tRNA合成酶的校准机制

• 发表时间: 2007
• 作者: 佐々木 浩;関根 俊一;横山 茂之
• 通讯作者: 横山 茂之