亜鉛フィンガータンパク質の標的DNA配列への巻付き過程の解明と分子設計への展開

阐明锌指蛋白围绕靶DNA序列的缠绕过程及其在分子设计中的应用

基本信息

批准号：
07J00755
负责人：
森崎達也
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J00755/
关键词：
亜鉛フィンガー DNA結合様式

项目摘要

亜鉛フィンガー(ZNF)タンパク質は、その結合特性から人工的に新規DNA結合タンパク質をデザインする骨格として非常に優れているが、最も根本的な問いかけである、その標的DNAへの巻付き過程については殆ど研究が行われておらず、未だに明らかにされていない。今年度は、ZNFタンパク質の細胞内挙動を明らかにするため、FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)解析を行うことでZNFタンパク質の細胞内拡散に関する知見を得ることを試みた。Zif268タンパク質をもとにして、3、4、5、6及び9フィンガータンパク質を作製し、それらのFRAP解析を行った結果、フィンガー数の増加に伴って、核内での拡散速度が顕著に低下することが明らかとなった。これに対して、細胞質においては、ZNFタンパク質はフィンガーの数に依存せず速やかな蛍光回復曲線を示すことが明らかになった。DNA非結合型ZNFタンパク質をデザインし、FRAP解析を行った結果、核内においてフィンガーの数に依存せず速やかな蛍光回復を示した。ここで、6フィンガータンパク質とヒストンH2Bの局在を同時に観察したところ、6フィンガータンパク質がヌクレオソームが密でない領域、つまりクロマチンが比較的オープンな領域に分布する傾向が示唆された。ゲノム中の単一配列への標的化にはZNFのマルチ化が有効であるが、それと同時に、セミスペシフィック標的配列との強い相互作用を生じることもあり、結果として、細胞内での機能発現の遅延などの影響を及ぼす可能性が考えられる。このため、これらの細胞内挙動及び標的DNA配列への巻付き過程を明らかにすることは、今後人工マルチZNFタンパク質の機能を最適化する上でも重要な情報を提供するものであるとをえうれる。

锌指（ZNF）蛋白非常出色，因为它们由于其结合特性而用于人为设计新型DNA结合蛋白的骨架，但是对最基本的问题，包装靶DNA的过程进行的研究很少，尚未澄清。今年，为了阐明ZNF蛋白的细胞内行为，我们试图通过进行FRAP（光漂白后的荧光恢复）分析来深入了解ZnF蛋白的细胞内扩散。基于ZIF268蛋白，制备了3、4、5、6和9指的蛋白质，对它们的FRAP分析表明，随着手指数量的增加，细胞核内的扩散速率显着降低。相比之下，有发现在细胞质中，ZnF蛋白表现出与手指数量无关的荧光回收曲线。设计了DNA无ZNF蛋白，FRAP分析显示核中的荧光恢复迅速，与手指的数量无关。在这里，同时观察到六个手指蛋白和组蛋白H2b的定位，这表明六个手指蛋白倾向于分布在核小体不致密的区域，即在染色质相对开放的区域。 ZNF的乘法可有效靶向基因组中的单个序列，但与此同时，它也可能引起与半特异性目标序列的强烈相互作用，这可能导致细胞中功能表达延迟。因此，很明显，阐明这些细胞内行为并包裹到目标DNA序列的过程将为未来优化人工多ZNF蛋白的功能提供重要信息。