亜鉛フィンガータンパク質の標的DNA配列への巻付き過程の解明と分子設計への展開

阐明锌指蛋白围绕靶DNA序列的缠绕过程及其在分子设计中的应用

基本信息

批准号：
07J00755
负责人：
森崎達也
金额：
$ 1.73万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2007
资助国家：
日本
起止时间：
2007 至 2009
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-07J00755/
关键词：
亜鉛フィンガー DNA結合様式

项目摘要

亜鉛フィンガー(ZNF)タンパク質は、その結合特性から人工的に新規DNA結合タンパク質をデザインする骨格として非常に優れているが、最も根本的な問いかけである、その標的DNAへの巻付き過程については殆ど研究が行われておらず、未だに明らかにされていない。今年度は、ZNFタンパク質の細胞内挙動を明らかにするため、FRAP(Fluorescence Recovery After Photobleaching)解析を行うことでZNFタンパク質の細胞内拡散に関する知見を得ることを試みた。Zif268タンパク質をもとにして、3、4、5、6及び9フィンガータンパク質を作製し、それらのFRAP解析を行った結果、フィンガー数の増加に伴って、核内での拡散速度が顕著に低下することが明らかとなった。これに対して、細胞質においては、ZNFタンパク質はフィンガーの数に依存せず速やかな蛍光回復曲線を示すことが明らかになった。DNA非結合型ZNFタンパク質をデザインし、FRAP解析を行った結果、核内においてフィンガーの数に依存せず速やかな蛍光回復を示した。ここで、6フィンガータンパク質とヒストンH2Bの局在を同時に観察したところ、6フィンガータンパク質がヌクレオソームが密でない領域、つまりクロマチンが比較的オープンな領域に分布する傾向が示唆された。ゲノム中の単一配列への標的化にはZNFのマルチ化が有効であるが、それと同時に、セミスペシフィック標的配列との強い相互作用を生じることもあり、結果として、細胞内での機能発現の遅延などの影響を及ぼす可能性が考えられる。このため、これらの細胞内挙動及び標的DNA配列への巻付き過程を明らかにすることは、今後人工マルチZNFタンパク質の機能を最適化する上でも重要な情報を提供するものであるとをえうれる。

锌指（ZNF）蛋白作为人为设计的新DNA结合蛋白的骨骼非常好，但大多数最基本的问题是尚未进行靶DNA中的处理过程。然而。今年，为了阐明ZNF蛋白的细胞内行为，我们试图通过分析摄影后的荧光回收率来获取有关ZnF蛋白质内细胞内扩散的知识。基于ZIF268蛋白，产生了3、4、5、6和9指的产生，而FRAP分析导致手指数量增加，导致手指的数量增加明确要做。另一方面，在细胞质中，发现ZnF蛋白显示出迅速的荧光回收曲线，而不是由于手指的数量。由于DNA -Non -Non结合ZnF蛋白和进行FRAP分析的设计，它显示了细胞核的迅速荧光回收率，而不管手指的数量多少。同时，一个6-手指的挥杆和HISTON H2B的定位表明，将6-手指tlag的五根涂料分布在核 - 溶剂不致密的区域，即在相对开放的区域中的染色质。覆盖ZNF可有效地靶向基因组中的单个序列，但与此同时，它可能与半指靶向序列具有很强的相互作用，从而导致细胞中的功能表达。影响，例如延迟。因此，阐明这些细胞中这些细胞的加工过程和目标DNA序列将提供重要的信息，以优化人工多-ZNF蛋白的功能。