siRNAライブラリーを用いた制癌剤感受性決定因子の網羅的検索とその作用機構解析

利用siRNA文库全面寻找抗癌药物敏感性决定因素并分析其作用机制

基本信息

批准号：
18790110
负责人：
高橋勉
金额：
$ 2.24万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790110/
关键词：
制癌剤テーラーメイド医療遺伝子 siRNA

项目摘要

癌の化学療法においては、制癌剤に対する反応性や副作用発現の程度には個人差が認められる。したがって、癌の化学療法の効果を向上させるためには治療の個別化(テーラーメイド治療)の実現が必須であり、そのためには個々の制癌剤に対する感受性を決定する遺伝子群の解析が不可欠となる。本研究では、siRNAライブラリーを利用して、発現抑制(ノックダウン)することによって制癌剤(アドリアマイシン)感受性に影響を与える遺伝子群の網羅的スクリーニング方法を確立した。まず、レンチウイルス感染法を用いて、約50,000種のヒト遺伝子のmRNAを標的にしたsiRNAライブラリーをヒト胎児腎由来HEK293細胞に導入した。このsiRNAライブラリー導入細胞を半数致死濃度のアドリアマイシン存在下で培養し、生き残った細胞からtotal RNAを抽出した。次に、得られたtotal RNAの逆転写産物を鋳型として、siRNA配列部分を特異的に増幅するプライマーを用いてPCRを行った。このPCR産物をプローブとしてマイクロアレイ解析を行い、アドリアマイシン処理によって変動がみられた遺伝子群を選出した。特に高い変動率を示した遺伝子群を着目し、それらの遺伝子をターゲットとするsiRNAをHEK293細胞に導入し、アドリアマイシン感受性を検討した。その結果、発現抑制によって細胞にアドリアマイシン耐性を与える因子としてZNF452、発現抑制によって細胞にアドリアマイシン高感受性を与える因子としてKCNT1,STEAP3を同定することに成功した。これらの因子は全てアドリアマイシン毒性との関係について示唆されたことのないものであった。したがって、本研究で構築したスクリーニング方法を用いれば、未知の制癌剤感受性決定因子の同定が可能であり、制癌剤感受性の個人差決定機構の解明研究に大きな発展をもたらすものと期待される。

在癌症的化学疗法中，对副作用的反应性和程度认识到个体差异。因此，为了改善癌症化疗的影响，必须实现治疗个性化（量身定制治疗）至关重要，这对于分析决定对个体癌症敏感性的基因组至关重要。在这项研究中，通过使用siRNA文库抑制癌症敏感性的基因组的全面筛选方法（aDRIA MIRCIN）敏感性（敲除）。首先，使用Lench病毒感染方法，将靶向约50,000种人类基因的mRNA的siRNA文库引入了来自人类胎儿肾脏的HEK293细胞中。将此siRNA文库引入的细胞培养为Adria mycin的半致死密度，并从存活的细胞中提取总RNA。接下来，使用底漆进行PCR，该引物通过获得的总RNA反向副本专门放大了siRNA序列部分。使用该PCR产物作为探针进行了微射线分析，并选择了Adria mycin加工波动的基因组。他们专注于具有特别高波动率的基因组，他们引入了siRNA，针对这些基因，并检查了阿德里亚菌蛋白的敏感性。结果，它成功地将ZnF452鉴定为通过抑制细胞和KCNT1和STEP3作为将细胞赋予细胞抗性细胞迈克蛋白耐药性的因素，作为将细胞传达给细胞的因素。所有这些因素从未提出与Adria Mycin毒性的关系。因此，使用本研究中构建的筛选方法，可以鉴定未知的癌症对比剂的敏感因素，并且可以预期它将在解决癌症敏感性的个体差异方面带来巨大的发展。