高感度かつ選択的な脱塩基損傷検出試薬の開発

高灵敏、选择性无碱基损伤检测试剂的研制

• 批准号: 18790023
• 负责人: 佐藤 浩輔
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18790023/
• 关键词: 遺伝子損傷; 検出試薬; 蛍光; 核酸; 生体分子; 有機化学

昨年度に引き続き、5-ホルミルウリジンと高い反応性をもつ新規試薬のデザインと合成を行った。その結果、フェニル基のパラ位にメトキシ基を有する化合物が、塩基性条件下極めて強い蛍光を発することが明らかとなった。一連の反応後の蛍光化合物について種々の蛍光物理定数の算出を行った結果、メトキシ誘導体のものはその蛍光量子収率が0.8以上となり、核酸誘導体として水中でも極めて強い蛍光を発する化合物を見いだすことができた。また、予期していた通り、これらの新規検出試薬はバックグラウンドとなる蛍光を示さなかった。つぎに生体内で最も多く生成すると考えられるホルミル誘導体である、脱塩基損傷に対する選択性をまず単量体を用いて確認した。その結果、脱塩基損傷は新規試薬と速やかに反応するものの、得られた試薬との付加体は全く蛍光を示さなかった。さらに天然型のDNAに含まれるデオキシアデノシン、デオキシグアノシン、デオキシシチジン、チミジンについても同様にその反応性を比較検討した。これらの天然型核酸はいずれも新規検出試薬と反応せず、蛍光も観察されないことを明らかにした。そのため、本試薬は蛍光による検出を行うことで、5-ホルミルウリジンを選択的に検出することが可能であると考えられる。つづいて、昨年度に合成したオリゴヌクレオチドへ5-ホルミルウリジンを導入するためのユニットを用いて1個の5-ホルミルウリジンを含む15量体のオリゴヌクレオチドを合成した。このオリゴヌクレオチドに対して、新規試薬との反応を行った結果、新規試薬は水中のオリゴヌクレオチドとも反応することがわかった。このことは実際に細胞等から得られたDNAに対して反応を行うにあたり、極めて重要な結果であると考えられる。

继去年之后，我们设计合成了一种与5-甲酰尿苷具有高反应活性的新试剂。结果表明，在苯基的对位具有甲氧基的化合物在碱性条件下发出极强的荧光。通过一系列反应后计算荧光化合物的各种荧光物理常数，我们发现甲氧基衍生物的荧光量子产率为0.8或更高，并且我们发现了一种即使在水中也能发出极强荧光的核酸化合物我能够做到。此外，正如预期的那样，这些新的检测试剂没有显示出背景荧光。接下来，我们首先确认了甲酰基衍生物对无碱基损伤的选择性，这被认为是使用单体在体内产生的最丰富的甲酰基衍生物。结果，虽然脱碱基损伤迅速与新试剂反应，但所得的与试剂的加合物没有显示任何荧光。此外，类似地比较和检查了天然DNA中所含的脱氧腺苷、脱氧鸟苷、脱氧胞苷和胸苷的反应性。结果表明，这些天然核酸均未与新检测试剂发生反应，也没有观察到荧光。因此，认为该试剂可以通过进行荧光检测来选择性地检测5-甲酰尿苷。接下来，使用用于将5-甲酰基尿苷引入到去年合成的寡核苷酸中的单元，合成了含有1个5-甲酰基尿苷的15聚体寡核苷酸。使该寡核苷酸与新试剂反应的结果发现，该新试剂也与水中的寡核苷酸反应。当实际对从细胞获得的DNA进行反应时，这被认为是极其重要的结果。