酵母における蛋白質合成阻害ストレスに対するmRNA安定化制御機構の研究

酵母响应蛋白质合成抑制应激的mRNA稳定控制机制研究

基本信息

批准号：
18780065
负责人：
高久洋暁
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nigata University of Phermacy and Applied Life Sciences
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

酵母Candida maltosaは蛋白質合成阻害剤であるシクロヘキシミド(CYH)に対し、生育の一時停止後に再び生育が回復する誘導的耐性を示す。これは、CYH添加後、転写活性化因子C-Gcn4pが、CYH耐性L41リボソーム蛋白質遺伝子(L41-Q)の転写を誘導し、CYH耐性型リボソームが合成されることに起因する。CYH添加後及びヒスチジン飢餓を誘導する3-AT添加後の転写活性化因子C-Gcn4pの制御をmRNA、蛋白質レベルにおいて解析するため、GFP又はHAタグと融合したC-Gcn4pの検出を試みたが、十分に解析できるレベルのものは構築できなかった。そこでFLAGタグ融合型C-Gcn4pを用いたところ、機能も相補、検出感度も解析に十分であった。FLAGタグ融合型C-GCN4をC-GCN4破壊株に導入し、3-AT或いはCYH添加後のC-GCN4mRNA、蛋白質レベルの解析を行った。3-AT添加後、C-GCN4mRNA量の上昇率以上にC-Gcn4p量の上昇率が大きかったので、転写、翻訳段階における制御、特に翻訳制御が大きく寄与していることが示唆された。CYH添加1時間後、C-GCN4 mRNA量は一時的に大きく上昇するが、逆にC-Gcn4p量は減少した。その後、C-GCN4mRNA量は減少するが、逆にC-Gcn4p量は増加し、CYH添加前の約1.5倍まで上昇し、一定となった。すなわち、CYHによるmRNAの安定化で一時的にRNA量は上昇するが、CYH添加直後の蛋白質合成は厳しく抑制されるためにC-Gcn4p量は減少したと考えられた。その後、C-Gcn4pの上昇ともにL41-Q転写誘導が促進されたが、C-Gcn4p量が一定量になったにもかかわらず、転写誘導効率がその後数時間上昇し続けたことから、C-Cpc2pなどのC-Gcn4p活性調節因子の関与の可能性が考えられた。

麦芽糖酵母对蛋白质合成抑制剂放线菌酮 (CYH) 表现出诱导性抗性，这会导致生长在暂时停止后恢复。这是因为，添加CYH后，转录激活剂C-Gcn4p诱导CYH抗性L41核糖体蛋白基因(L41-Q)的转录，并合成CYH抗性核糖体。为了在mRNA和蛋白质水平上分析添加CYH和添加3-AT后诱导组氨酸饥饿的转录激活剂C-Gcn4p的调节，我们尝试检测与GFP或GFP融合的C-Gcn4p。然而，不可能构建可以充分分析的东西。因此，当我们使用FLAG标签融合的C-Gcn4p时，功能互补并且检测灵敏度足以进行分析。将融合有 FLAG 标签的 C-GCN4 引入 C-GCN4 破坏的菌株中，并在添加 3-AT 或 CYH 后分析 C-GCN4 mRNA 和蛋白质水平。添加3-AT后，C-Gcn4p量的增加率大于C-GCN4 mRNA量的增加率，这表明转录和翻译阶段的调节，特别是翻译控制，使得C-GCN4 mRNA的量增加。贡献大。添加CYH后1小时，C-GCN4 mRNA的量暂时显着增加，但相反，C-Gcn4p的量减少。此后，C-GCN4 mRNA的量减少，但C-Gcn4p的量相反增加，达到添加CYH之前水平的约1.5倍，并保持恒定。即，虽然由于CYH使mRNA稳定化而使RNA量暂时增加，但认为添加CYH后蛋白质合成立即受到严重抑制，因此C-Gcn4p的量减少。此后，随着C-Gcn4p的增加，L41-Q转录诱导得到促进，但即使C-Gcn4p的量达到一定水平，转录诱导效率在随后的几个小时内持续增加，表明C-Gcn4p的可能性考虑了 C-Gcn4p 活性调节剂如 Cpc2p 的参与。