新規の葉緑体タンパク質分解系:RCB経路の分子機構

新型叶绿体蛋白降解系统：RCB途径的分子机制

• 批准号: 18780042
• 负责人: 石田 宏幸
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18780042/
• 关键词: Rubisco; 老化; 植物; オートファジー; 葉緑体; 分解; シロイヌナズナ

本研究では、窒素転流機構と光合成機能維持の両面から植物の生長に深く関わる老化葉における葉緑体タンパク質の分解機構について分子レベルで明らかにすることを目的とし、本年度は以下の2項目について実験を行った。(1)RCB経路に関わるプロテオーム解析先に確立した葉緑体移行GFP発現シロイヌナズナと共焦点レーザー顕微鏡を用いたRCBの生葉における可視化法を用いて、RCBが蓄積した液胞を単離し、これとRCBが蓄積していない液胞を2次元電気泳動に供し、両者で差異の見られるポリペプチドのスポット群を特定することを試みた。まずRCBを含む液胞を単離する方法について検討した。RCBを形成させた葉からセルラーゼとペクチナーゼを用いた酵素法によりプロトプラストを単離した。その後、プロトプラストを破砕し液胞を遊離させた後、パーコールによる密度勾配超遠心法により液胞を単離した。単離した液胞にはRCBの存在が確認された。しかし、液胞画分には少量ながら葉緑体の混入が認められた。よってRCBのプロテオーム解析を行うためにはさらなる精製方法の確立が必要であることがわかった。(2)ストロミュール形成変異体の選抜葉緑体移行GFP発現シロイヌナズナの種子にEMS処理を行い、突然変異体のプールを作成した。この中からストロミュールの形成に異常の見られる変異体を共焦点レーザー顕微鏡により選抜する方法を確立した。17000個体のM2植物から、複数の変異個体を得た。さらに得られた変異個体について戻し交配、異なるエコタイプとの交配を進め、原因遺伝子同定のための材料を整備した。

本研究的目的是从分子水平上从氮转运机制和光合功能的维持两个方面阐明衰老叶片中叶绿体蛋白质的分解机制，该机制与植物生长密切相关。 (1)与RCB途径相关的蛋白质组分析利用之前建立的新鲜叶中RCB的可视化方法，使用叶绿体转位的表达GFP的拟南芥和共聚焦激光显微镜，我们分离了RCB积累的液泡，并且我们对RCB积累的液泡进行了分析。不积累到二维电泳，并试图鉴定显示两者之间差异的多肽斑点组。首先，我们研究了一种分离含有 RCB 的液泡的方法。使用纤维素酶和果胶酶通过酶促方法从形成 RCB 的叶子中分离原生质体。此后，破坏原生质体以释放液泡，然后使用Percoll通过密度梯度超速离心分离液泡。在分离的液泡中证实了 RCB 的存在。然而，在液泡部分中观察到少量叶绿体。因此，我们发现有必要建立进一步的纯化方法来进行RCB的蛋白质组分析。 (2)基质形成突变体的选择用EMS处理表达叶绿体转位GFP的拟南芥种子以创建突变体池。我们建立了一种使用共焦激光显微镜选择基质形成异常突变体的方法。从 17,000 株 M2 植物中获得了多个突变体。此外，将获得的突变体回交并与不同生态型杂交，以制备鉴定致病基因的材料。

项目成果

窒素転流とRCB輸送を介しての液胞中のRubisco分解

Rubisco 通过氮易位和 RCB 运输在液泡中降解

• 发表时间: 2008
• 作者: Ishida;H.;et. al.;石田 宏幸
• 通讯作者: 石田 宏幸

Visualization of Rubisco-containing bodies derived from chloroplasts in living cells of Arabidopsis

拟南芥活细胞中叶绿体衍生的含 Rubisco 体的可视化

• 发表时间: 2008
• 期刊: Proceedings Photosynthesis Research 2007 (印刷中)
• 作者: Ishida;H.;et. al.
• 通讯作者: et. al.