構造解析に基づくLINE型レトロトランスポゾンの転移機構の解明

基于结构分析阐明LINE型反转录转座子转座机制

• 批准号: 18770090
• 负责人: 真板 宣夫
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: The University of Tokushima (2007)Kyushu University (2006)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770090/
• 关键词: レトロトランスポゾン; X線結晶構造解析

前年度の結果に基づき、カイコ由来のLINEであるSART1のORF2pのC末のZnフィンガードメインを削ったもの(ΔC)の精製を進めた。タンパク質からの核酸の除去はうまくいったものの、十分な量が取れないこととアグリゲーションを起こしやすいことから、結晶化や限定分解によるドメインマッピングなど当初予定していた解析に持ち込むことは困難であった。そのほかに、C末のZnフィンガードメインのみの発現系も構築し精製を試みたが、発現レベル自体が非常に低かった。次にLINE型レトロトランスポゾンの標的配列特異性を明らかにするために、カイコ由来のTRAS1のORF2pN末に存在するエンドヌクレアーゼドメインと標的DNAとの複合体の結晶化を試みた。前年度までに2,8Åのデータが得られていたが、DNA分子は確認できなかった。両端にG:C配列を入れてDNAの安定性を高める工夫を行ったところ、最大2.0Åまで分解能が向上した。高分解能データのおかげでDNAの電子密度が認められたが、占有率が低いためDNA分子をモデリングするのは困難であった。DNA一分子にタンパク質二分子結合しており、予想外の相互作用であった。DNAの占有率を高めるため、タンパク質のディスオーダー領域を削ってみたが改善されなかった。更なるDNA配列の工夫を要すると思われる。LINE型レトロトランスポゾンであるR1Bmのエンドヌクレアーゼドメインについては、構造および機能解析のデータをまとめ、6月に核酸専門国際誌に論文が掲載された。R1Bmについても同様に標的DNAとの複合体結晶化を試みたが成功しなかったので、浸潤法による複合体結晶に向けてDNAのデザインを進めている。

根据上一年的结果，我们开始净化ORF2P ORF2P的Zn指域（ΔC），ORF2P是蚕源线的ORF2P，然后从SART1的C端Zn指域中取出。尽管从蛋白质中取出核酸是成功的，但很难进行初始分析，例如通过结晶和有限分解的域映射，因为无法获得足够的量，并且很可能会导致聚集。此外，我们还仅针对C末端Zn手指结构域构建了一个表达系统，并试图纯化它，但是表达水平本身非常低。接下来，为了阐明线型逆转录子的目标序列特异性，我们试图在丝虫中从丝虫的ORF2PN端子上存在内核酸酶域和存在的靶DNA之间的复合物。前一年获得了2,8Å的数据，但无法确认DNA分子。通过在两端添加G：C序列以提高DNA稳定性，分辨率提高到最大2.0Å。尽管高分辨率数据显示DNA中的电子密度，但由于占用率低，很难对DNA分子进行建模。这是与两个与一个DNA分子结合的蛋白质的意外相互作用。我试图减少蛋白质无序区域以增加DNA占用率，但没有改善。似乎需要进一步的DNA序列。 R1BM的核酸内切酶域是一种线型逆转座子，并于6月发表在《国际核酸国际杂志》上。同样，我们试图用R1BM与靶DNA结晶，但尚未成功，因此我们现在使用浸润方法将DNA朝向复杂晶体。

项目成果

Characterization of the sequence specificity of the RIBm endnuclease domain by structural and biochemical studies.

通过结构和生化研究表征 RIBm 核酸内切酶结构域的序列特异性。

• 发表时间: 2007
• 期刊: NucleicAcidsResearch 35
• 作者: Ueno;T.;et al.;海野昌喜;Shusuke Kusama;Masaki Unno;草間周介;齋藤正男;海野昌喜;海野昌喜;草間周介;海野昌喜;篠原正将;Masao Ikeda-Saito;Masaki Unno;Masaki Unno;Kei Wada;Toshihiro Okada;和田 啓;下村 喜充;Kei Wada;Keiichi Fukuyama;和田 啓;下村 喜充;NobuoMaita
• 通讯作者: NobuoMaita