構造解析に基づくLINE型レトロトランスポゾンの転移機構の解明

基于结构分析阐明LINE型反转录转座子转座机制

• 批准号: 18770090
• 负责人: 真板 宣夫
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: The University of Tokushima (2007)Kyushu University (2006)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-18770090/
• 关键词: レトロトランスポゾン; X線結晶構造解析

前年度の結果に基づき、カイコ由来のLINEであるSART1のORF2pのC末のZnフィンガードメインを削ったもの(ΔC)の精製を進めた。タンパク質からの核酸の除去はうまくいったものの、十分な量が取れないこととアグリゲーションを起こしやすいことから、結晶化や限定分解によるドメインマッピングなど当初予定していた解析に持ち込むことは困難であった。そのほかに、C末のZnフィンガードメインのみの発現系も構築し精製を試みたが、発現レベル自体が非常に低かった。次にLINE型レトロトランスポゾンの標的配列特異性を明らかにするために、カイコ由来のTRAS1のORF2pN末に存在するエンドヌクレアーゼドメインと標的DNAとの複合体の結晶化を試みた。前年度までに2,8Åのデータが得られていたが、DNA分子は確認できなかった。両端にG:C配列を入れてDNAの安定性を高める工夫を行ったところ、最大2.0Åまで分解能が向上した。高分解能データのおかげでDNAの電子密度が認められたが、占有率が低いためDNA分子をモデリングするのは困難であった。DNA一分子にタンパク質二分子結合しており、予想外の相互作用であった。DNAの占有率を高めるため、タンパク質のディスオーダー領域を削ってみたが改善されなかった。更なるDNA配列の工夫を要すると思われる。LINE型レトロトランスポゾンであるR1Bmのエンドヌクレアーゼドメインについては、構造および機能解析のデータをまとめ、6月に核酸専門国際誌に論文が掲載された。R1Bmについても同様に標的DNAとの複合体結晶化を試みたが成功しなかったので、浸潤法による複合体結晶に向けてDNAのデザインを進めている。

基于去年的结果，我们对SART1（来自蚕的LINE）的ORF2p进行了纯化，其中C末端Zn指结构域被删除（ΔC）。虽然从蛋白质中去除核酸是成功的，但很难进行最初计划的分析，例如通过结晶或有限降解进行结构域图谱，因为无法获得足够的量，并且很可能发生聚集。此外，我们构建了仅C端Zn指结构域的表达系统并尝试对其进行纯化，但表达水平本身很低。接下来，为了阐明LINE型反转录转座子的靶序列特异性，我们尝试使家蚕TRAS1的ORF2pN末端的核酸内切酶结构域与靶DNA之间的复合物结晶。 2.8 Å 的数据已于去年获得，但无法确认任何 DNA 分子。通过在两端添加 G:C 序列以提高 DNA 的稳定性，分辨率最高提高至 2.0 Å。高分辨率数据使研究人员能够了解 DNA 的电子密度，但低占有率使得 DNA 分子建模变得困难。两个蛋白质分子与一个 DNA 分子结合，这是一种意想不到的相互作用。我尝试去除蛋白质的无序区域以增加DNA占用率，但没有发现任何改善。看来需要进一步设计DNA序列。关于LINE型逆转录转座子R1Bm的核酸内切酶结构域，我们整理了结构和功能分析的数据，并于6月份在国际核酸专业杂志上发表了一篇论文。我们同样尝试用 R1Bm 的目标 DNA 结晶复合物，但没有成功，因此我们正在使用渗透法继续进行 DNA 设计，以实现复合物结晶。

项目成果

Characterization of the sequence specificity of the RIBm endnuclease domain by structural and biochemical studies.

通过结构和生化研究表征 RIBm 核酸内切酶结构域的序列特异性。

• 发表时间: 2007
• 期刊: NucleicAcidsResearch 35
• 作者: Ueno;T.;et al.;海野昌喜;Shusuke Kusama;Masaki Unno;草間周介;齋藤正男;海野昌喜;海野昌喜;草間周介;海野昌喜;篠原正将;Masao Ikeda-Saito;Masaki Unno;Masaki Unno;Kei Wada;Toshihiro Okada;和田 啓;下村 喜充;Kei Wada;Keiichi Fukuyama;和田 啓;下村 喜充;NobuoMaita
• 通讯作者: NobuoMaita