顕微鏡視野内におけるDNA複製反応の1分子直接観察と形態制御技術の開発

显微视野内直接单分子观察DNA复制反应及形态控制技术的发展

基本信息

批准号：
06J50512
负责人：
栗田弘史
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J50512/
关键词：
1分子観察 DNA 蛍光観察 1分子操作

项目摘要

DNA合成および複製反応の1分子観察を目的として研究を進めた。1分子観察法は、従来行われてきた電気泳動などによる解析では平均値のなかに隠れてしまう個々の分子の挙動や集団の分布を明らかにできると期待されている手法である。DNA-タンパク質間相互作用では転写(RNA polymerase)、組換(RecA, RecBCD)に関与する因子の1分子動態解析が行われてきたが、DNA合成、DNA複製に関する1分子観察はほとんど行われていない。DNA合成、DNA複製反応の解析に1分子観察法を適用することで新たな知見を得ることが期待できる。本研究ではこれを実現するために(1)鋳型となる1本鎖DNA(ssDNA)を顕微鏡視野内で調製すること、(2)調製したssDNAを顕微鏡視野内で可視化および安定化させることについて重点的に研究した。(1)については蛍光顕微鏡視野内でexonucleaseIIIによる1分子DNA消化反応の可視化を行い、DNA合成の鋳型になりうる直鎖状ssDNAを顕微鏡視野内に調製できることを示した。またこの過程でDNAの形態がDNA消化反応に影響を及ぼしていることが1分子観察によって示された。このことは非常に興味深く、DNA合成などにも形態が関与している可能性が考えられる。(2)については真核細胞のssDNA結合タンパク質であるReplication Protein Aの蛍光標識技術を確立した。今後以上の成果を組み合わせることでDNA合成・DNA複製の可視化が可能になると考えられ、さらにDNAの形態がこれらの反応に寄与するかどうかも1分子観察により明らかにされると思われる。

该研究的目的是观察单个DNA合成和复制反应的分子。单分子观察方法是一种预期的方法，可以揭示单个分子的行为以及在常规分析（例如电泳）中隐藏在平均值内的种群的分布。在DNA蛋白相互作用中，已经对参与转录（RNA聚合酶）和重组（RECA，RECBCD）的因素进行单分子动力学分析，但是对DNA合成和DNA复制的单分子几乎没有观察到。通过将单个分子观察方法应用于DNA合成和DNA复制反应的分析，可以预期新发现。在这项研究中，为了实现这一目标，我们专注于（1）将单链DNA（ssDNA）作为显微镜领域中的模板制备，以及（2）在显微镜领域内可视化和稳定准备的ssDNA。关于（1），在荧光显微镜的视野中，使用核酸外切酶III可视化单分子DNA消化反应，这表明可以在显微镜视野内制备线性ssDNA（可以是DNA合成模板）。此外，对一个分子的观察结果表明，在此过程中，DNA形态影响了DNA消化反应。这很有趣，形态可能也参与了DNA合成。对于（2），我们已经建立了一种用于复制蛋白A的荧光标记技术，即真核细胞中的ssDNA结合蛋白。人们认为，通过结合更多结果，可以看到DNA合成和DNA复制，并且单分子观察也可能揭示DNA形态是否有助于这些反应。