顕微鏡視野内におけるDNA複製反応の1分子直接観察と形態制御技術の開発

显微视野内直接单分子观察DNA复制反应及形态控制技术的发展

基本信息

批准号：
06J50512
负责人：
栗田弘史
金额：
$ 0.64万
依托单位：
Toyohashi University of Technology
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至无数据
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J50512/
关键词：
1分子観察 DNA 蛍光観察 1分子操作

项目摘要

DNA合成および複製反応の1分子観察を目的として研究を進めた。1分子観察法は、従来行われてきた電気泳動などによる解析では平均値のなかに隠れてしまう個々の分子の挙動や集団の分布を明らかにできると期待されている手法である。DNA-タンパク質間相互作用では転写(RNA polymerase)、組換(RecA, RecBCD)に関与する因子の1分子動態解析が行われてきたが、DNA合成、DNA複製に関する1分子観察はほとんど行われていない。DNA合成、DNA複製反応の解析に1分子観察法を適用することで新たな知見を得ることが期待できる。本研究ではこれを実現するために(1)鋳型となる1本鎖DNA(ssDNA)を顕微鏡視野内で調製すること、(2)調製したssDNAを顕微鏡視野内で可視化および安定化させることについて重点的に研究した。(1)については蛍光顕微鏡視野内でexonucleaseIIIによる1分子DNA消化反応の可視化を行い、DNA合成の鋳型になりうる直鎖状ssDNAを顕微鏡視野内に調製できることを示した。またこの過程でDNAの形態がDNA消化反応に影響を及ぼしていることが1分子観察によって示された。このことは非常に興味深く、DNA合成などにも形態が関与している可能性が考えられる。(2)については真核細胞のssDNA結合タンパク質であるReplication Protein Aの蛍光標識技術を確立した。今後以上の成果を組み合わせることでDNA合成・DNA複製の可視化が可能になると考えられ、さらにDNAの形態がこれらの反応に寄与するかどうかも1分子観察により明らかにされると思われる。

我们进行了研究，目的是观察一个对DNA合成和重复反应的分子观察。一种分子观察方法是一种方法，可以预期能够阐明单个分子的行为以及隐藏在分析中平均值（例如已经执行的电气游泳）中的基团的分布。在DNA蛋白相互作用中，对重组（RNA聚合酶）涉及的因子（RNA聚合酶）的一个分子动态分析进行了重组（RECA，RECBCD），但大多数观察到DNA合成和DNA重复的观察结果。可以预期，将通过将一种 - 分子观察方法应用于DNA合成和DNA重复反应的分析来获得新知识。在这项研究中，（1）在显微镜场中捕获单个链的DNA（ssDNA），以及（2）我在显微镜领域中可视化和稳定的ssDNA。关于（1），已经表明，可以将可以成为DNA合成的直接链ssDNA可以在显微镜中制备到显微镜场中，从而在荧光显微镜场中通过外核酸异核酸酶来可视化一个 - 分子DNA消化反应。在此过程中，一个分子观察表明，DNA形式影响了DNA消化反应。这很有趣，并且可能与DNA合成有关。关于（2），建立了一种复制蛋白A的荧光标记技术，即真核细胞的ssDNA结合蛋白。人们认为，将来会有更多结果的组合可视化DNA合成和DNA重复，并且通过一个分子观察来揭示DNA形式是否有助于这些反应。