タンパク質のリン酸化を蛍光レシオ検出する人工低分子ペプチドプローブの開発

用于蛋白质磷酸化荧光比值检测的人工低分子量肽探针的开发

基本信息

批准号：
06J09693
负责人：
野中洋
金额：
$ 1.79万
依托单位：
Kyoto University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

项目摘要

初年度(平成18年度)は、ハイパーリン酸化配列を認識する人工ペプチドプローブ分子の研究過程において、チロシンを基本骨格とする2核の亜鉛錯体DpaTyr/2Znの置換基にクロロアセチル基をもつプローブが、特定のアミノ酸配列(Cys-Ala6-Asp4)と親和性を有するだけでなく迅速に共有結合標識が可能であることを偶然発見した。これまで、人工低分子と短鎖ペプチド配列との組み合わせによる、共有結合標識手法はほぼ存在していない。そのため、このような配列をタンパク質標識のためのタグとして用いることで、新規のタンパク質標識手法として提案することを目指してきた。前年度(平成19年度)は、実際にタンパク質にタグを融合した状態で発現させ評価を行った。タグを導入したモデルタンパク質に対して、プローブとなるDpaTyr/2Zn誘導体を添加することで、完全水系において数十分という短時間でのラベル化が可能であった。続いてタンパク質間での選択性を評価するために、多種タンパク質共存下において同様の評価をおこなった結果、タグつきタンパク質に対して選択的な修飾が可能であった。本年度(平成20年度)は、Gタンパク質共役受容体に対して標識を試みた。受容体の細胞外領域にタグ配列を導入し、HEK293細胞に発現させた。この細胞を蛍光プローブで染色したところ、受容体を発現している細胞上に標識由来の蛍光が観測された。この蛍光は細胞膜上の受容体局在と一致したことから、タグ導入受容体に対する選択的な標識であることが示された。分子認識による選択性と化学反応の選択性を融合させた本手法が、夾雑系において有効なタンパク質標識手法となりうることを示すことができた。本手法は生体機能を支える重要なタンパク質の局在や動態を観測するバイオイメージング研究や、タンパク質工学のための分子ツールとしての貢献が期待できると思われる。

第一年（2006年），在研究识别过度磷酸化序列的人工肽探针分子过程中，开发了一种以氯乙酰基作为DpaTyr/2Zn（一种以酪氨酸为基本骨架的双核锌配合物）取代基的探针。偶然发现它不仅对特定的氨基酸序列（Cys-Ala6-Asp4）有亲和力，而且可以快速共价标记。迄今为止，几乎没有使用人工小分子和短肽序列组合的共价标记技术。因此，我们的目的是提出一种新的蛋白质标记方法，利用这样的序列作为蛋白质标记的标签。去年（2007财年），我们实际上表达并评估了一种融合了标签的蛋白质。通过将 DpaTyr/2Zn 衍生物作为探针添加到标记的模型蛋白中，可以在几十分钟的短时间内在完全水性的系统中对其进行标记。随后，为了评价蛋白质之间的选择性，在各种蛋白质的共存中进行了类似的评价，结果，可以选择性地修饰标记的蛋白质。今年（2008年），我们尝试标记G蛋白偶联受体。将标签序列引入受体的胞外区域并在 HEK293 细胞中表达。当用荧光探针对这些细胞进行染色时，在表达受体的细胞上观察到源自标记的荧光。这种荧光与细胞膜上的受体定位一致，表明它是标记受体的选择性标记。我们能够证明，这种方法结合了分子识别的选择性和化学反应的选择性，可以成为污染系统中有效的蛋白质标记方法。该方法预计将有助于生物成像研究，观察支持生物功能的重要蛋白质的定位和动态，并作为蛋白质工程的分子工具。