タンパク質のリン酸化を蛍光レシオ検出する人工低分子ペプチドプローブの開発

用于蛋白质磷酸化荧光比值检测的人工低分子量肽探针的开发

• 批准号: 06J09693
• 负责人: 野中 洋
• 金额: $ 1.79万
• 依托单位: Kyoto University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2006
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2006 至 2008
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J09693/
• 关键词: 共有結合標識; ペプチドタグ; 分子認識; 受容体; バイオイメージング; タンパク質タグ; ハイパーリン酸化; リン酸化タンパク質; 金属配位子相互作用; ペプチドプローブ; 共有結合標識; ペプチドタグ; 分子認識; 受容体; バイオイメージング; タンパク質タグ; ハイパーリン酸化; リン酸化タンパク質; 金属配位子相互作用; ペプチドプローブ

初年度(平成18年度)は、ハイパーリン酸化配列を認識する人工ペプチドプローブ分子の研究過程において、チロシンを基本骨格とする2核の亜鉛錯体DpaTyr/2Znの置換基にクロロアセチル基をもつプローブが、特定のアミノ酸配列(Cys-Ala6-Asp4)と親和性を有するだけでなく迅速に共有結合標識が可能であることを偶然発見した。これまで、人工低分子と短鎖ペプチド配列との組み合わせによる、共有結合標識手法はほぼ存在していない。そのため、このような配列をタンパク質標識のためのタグとして用いることで、新規のタンパク質標識手法として提案することを目指してきた。前年度(平成19年度)は、実際にタンパク質にタグを融合した状態で発現させ評価を行った。タグを導入したモデルタンパク質に対して、プローブとなるDpaTyr/2Zn誘導体を添加することで、完全水系において数十分という短時間でのラベル化が可能であった。続いてタンパク質間での選択性を評価するために、多種タンパク質共存下において同様の評価をおこなった結果、タグつきタンパク質に対して選択的な修飾が可能であった。本年度(平成20年度)は、Gタンパク質共役受容体に対して標識を試みた。受容体の細胞外領域にタグ配列を導入し、HEK293細胞に発現させた。この細胞を蛍光プローブで染色したところ、受容体を発現している細胞上に標識由来の蛍光が観測された。この蛍光は細胞膜上の受容体局在と一致したことから、タグ導入受容体に対する選択的な標識であることが示された。分子認識による選択性と化学反応の選択性を融合させた本手法が、夾雑系において有効なタンパク質標識手法となりうることを示すことができた。本手法は生体機能を支える重要なタンパク質の局在や動態を観測するバイオイメージング研究や、タンパク質工学のための分子ツールとしての貢献が期待できると思われる。

在第一年（2006年）中，在识别高磷酸化序列的人造肽探针分子的研究过程中，我们意外地发现，在二核锌复杂DPATYR/2PATYR/2ZN取代基于酪氨酸的氯乙酰基的探针中，基于酪氨酸的快速序列，不仅具有特定的氨基酸序列（Cys-App），但也具有特定的氨基酸序列（Cys-Apt），但共价标记。到目前为止，使用人造小分子和短链肽序列的组合，几乎没有共价标记方法。因此，通过将这样的序列用作蛋白质标记的标签，它旨在将其作为一种新型的蛋白质标记技术提出。在上一年（2007年）中，通过在标签实际融合的状态下表达蛋白质来评估结果。通过将DPATYR/2ZN衍生物添加到引入标签的模型蛋白中，可以在完整的水性系统中短时间内标记该蛋白质。随后，为了评估蛋白质之间的选择性，在存在多种蛋白质的情况下进行了类似的评估，因此，可以选择性修饰标记的蛋白质。今年（2008年），我们试图标记G蛋白偶联受体。将TAG序列引入受体的细胞外区域，并在HEK293细胞中表达。当细胞用荧光探针染色时，在表达受体的细胞上观察到标记衍生的荧光。这种荧光与细胞膜上的受体定位一致，表明它是标记转移受体的选择性标签。已经表明，通过分子识别和化学反应中选择性结合选择性的方法可以是污染系统中有效的蛋白质标记技术。可以预期这种方法有助于生物成像研究，该研究观察了支持生物学功能的重要蛋白质的定位和动力学，并作为蛋白质工程的分子工具。