環境遺伝子資源からの有用酸化酵素の効率的探索技術の開発とその応用

环境遗传资源有用氧化酶高效检索技术开发及其应用

基本信息

批准号：
06J00383
负责人：
古屋俊樹
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J00383/
关键词：
酸化酵素モノオキシゲナーゼ環境遺伝子資源ナフトエ酸 P450 FT ICR MS 酸化反応 FT-ICR MS

项目摘要

酸化反応は物質変換において最も重要な反応のひとつであり、酸化酵素は常温、常圧下で選択性の高い反応を実現することから環境調和型の触媒として有用である。環境遺伝子資源からの有用酸化酵素の効率的探索技術の開発とその応用を目的として、本年度はまず、昨年度取得した新規酸化酵素の機能解析を詳細に行った。本酵素は2-ナフトエ酸に対して酸化活性を有しているが、NMR解析により2-ナフトエ酸を7-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸および8-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸に変換することを明らかにした。また、生成物の蛍光特性を検討し、8-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸は紫外線照射下で白色に近い蛍光を発することを見出した。本酵素遺伝子を大腸菌内で電子伝達系タンパク質遺伝子と共発現させて組換え株による2-ナフトエ酸の変換を試みたところ、1mMの2-ナフトエ酸を2時間で0.27mMの7-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸と0.46mMの8-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸に変換した。さらに、本酵素は基質特異性が広く、NMR解析により各生成物の構造も決定した。一方、土壌から抽出したDNAを鋳型としてPCR法により酸化酵素遺伝子をクローニングしてライブラリーを構築した。ライブラリーからインジゴによる呈色を指標としてインドール酸化酵素の取得を試みたが、ポジティブクローンの取得には至らなかった。以上のように本研究では、環境遺伝子資源から酸化酵素遺伝子をクローニングする手法の確立、および有用酸化酵素を探索する技術の開発、取得した酸化酵素の機能解析を実施した。今後は確立した手法、技術、得られた知見をもとに、酸化酵素を利用したバイオプロセスの構築へ向けて実用化研究を展開する予定である。

氧化反应是材料转化中最重要的反应之一，氧化酶可用作环境友好的催化剂，因为它们在室温和压力下实现高选择性反应。为了开发和应用从环境遗传资源中有效寻找有用氧化酶的技术，今年我们首先对去年获得的一种新氧化酶进行了详细的功能分析。该酶对2-萘甲酸具有氧化活性，NMR分析表明它将2-萘甲酸转化为7-羟基-2-萘甲酸和8-羟基-2-萘甲酸。我们还研究了产品的荧光特性，发现8-羟基-2-萘甲酸在紫外线照射下发出近白色荧光。当我们尝试使用重组菌株通过在大肠杆菌中共表达该酶基因与电子传递蛋白基因来转化 2-萘甲酸时，我们发现 1mM 2-萘甲酸在 2 中转化为 0.27mM 7-羟基-2小时-萘甲酸和0.46mM 8-羟基-2-萘甲酸。此外，该酶具有广泛的底物特异性，并且每种产物的结构均通过NMR分析确定。另一方面，以从土壤中提取的DNA为模板，通过PCR克隆氧化酶基因，构建文库。尝试以靛蓝显色为指示剂从文库中获取吲哚氧化酶，但未获得阳性克隆。如上所述，在本研究中，我们建立了从环境遗传资源中克隆氧化酶基因的方法，开发了寻找有用氧化酶的技术，并对获得的氧化酶进行了功能分析。未来，我们计划基于已建立的方法、技术和知识，对利用氧化酶构建生物过程进行实践研究。