環境遺伝子資源からの有用酸化酵素の効率的探索技術の開発とその応用

环境遗传资源有用氧化酶高效检索技术开发及其应用

基本信息

批准号：
06J00383
负责人：
古屋俊樹
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Waseda University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2006
资助国家：
日本
起止时间：
2006 至 2008
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-06J00383/
关键词：
酸化酵素モノオキシゲナーゼ環境遺伝子資源ナフトエ酸 P450 FT ICR MS 酸化反応 FT-ICR MS

项目摘要

酸化反応は物質変換において最も重要な反応のひとつであり、酸化酵素は常温、常圧下で選択性の高い反応を実現することから環境調和型の触媒として有用である。環境遺伝子資源からの有用酸化酵素の効率的探索技術の開発とその応用を目的として、本年度はまず、昨年度取得した新規酸化酵素の機能解析を詳細に行った。本酵素は2-ナフトエ酸に対して酸化活性を有しているが、NMR解析により2-ナフトエ酸を7-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸および8-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸に変換することを明らかにした。また、生成物の蛍光特性を検討し、8-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸は紫外線照射下で白色に近い蛍光を発することを見出した。本酵素遺伝子を大腸菌内で電子伝達系タンパク質遺伝子と共発現させて組換え株による2-ナフトエ酸の変換を試みたところ、1mMの2-ナフトエ酸を2時間で0.27mMの7-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸と0.46mMの8-ヒドロキシ-2-ナフトエ酸に変換した。さらに、本酵素は基質特異性が広く、NMR解析により各生成物の構造も決定した。一方、土壌から抽出したDNAを鋳型としてPCR法により酸化酵素遺伝子をクローニングしてライブラリーを構築した。ライブラリーからインジゴによる呈色を指標としてインドール酸化酵素の取得を試みたが、ポジティブクローンの取得には至らなかった。以上のように本研究では、環境遺伝子資源から酸化酵素遺伝子をクローニングする手法の確立、および有用酸化酵素を探索する技術の開発、取得した酸化酵素の機能解析を実施した。今後は確立した手法、技術、得られた知見をもとに、酸化酵素を利用したバイオプロセスの構築へ向けて実用化研究を展開する予定である。

氧化反应是材料转化中最重要的反应之一，氧化酶可作为环保催化剂有用，因为它们在室温和正常压力下实现高度选择性反应。为了开发和应用有效的搜索技术，以从环境遗传资源中使用有用的氧化酶，今年我们首先对去年获得的新氧化酶的功能分析进行了详细分析。尽管该酶对2-萘酸具有氧化活性，但NMR分析表明，它将2-萘甲酸转化为7-羟基-2-萘酸和8-羟基-2-萘酸。此外，研究了产品的荧光性能，发现在紫外线照射下，8-羟基-2-萘酸在白色附近发出荧光。该酶基因与大肠杆菌中的电子转移蛋白基因共表达，通过重组菌株转化2-萘酸，1 mm 2-萘酸转化为0.27 mm 7-羟基-7-羟基-2-羟基-2-萘二酸和0.46 mm 8-Hydroxy-2-nydroxy-2-Naphththaphththaphterthathoicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicicic in 2小时。此外，该酶具有广泛的底物特异性，每种产物的结构通过NMR分析确定。另一方面，使用从土壤中提取的DNA作为构造文库的模板，将氧化酶基因通过PCR克隆。我们试图以靛蓝色作为指标从文库中获得吲哚氧化酶，但没有获得阳性克隆。如上所述，在这项研究中，我们建立了一种从环境基因资源中克隆氧化酶基因的方法，开发了一项技术来寻找有用的氧化酶，并分析了对获得的氧化酶的功能分析。将来，我们计划基于所获得的既定方法，技术和知识，旨在使用氧化酶来建立生物过程。