立体構造を基にしたヌクレオチド除去修復機構の解析及び転写との共役機構の解析

基于3D结构的核苷酸切除修复机制分析及与转录的耦合机制分析

基本信息

  • 批准号:
    17770089
  • 负责人:
  • 金额:
    $ 2.11万
  • 依托单位:
  • 依托单位国家:
    日本
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
  • 财政年份:
    2005
  • 资助国家:
    日本
  • 起止时间:
    2005 至 2006
  • 项目状态:
    已结题

项目摘要

ヌクレオチド除去修復は様々なDNA傷害を認識・除去することができ、細菌では少なくとも7つの蛋白質、UvrA,UvrB,UvrC,UvrD,DNA ligase DNA polymerase,transcription-repair coupling factor(TRCF)が関与している。これまでにUvrB単独での立体構造解析を行い、ATPaseの活性測定からUvrAとUvrBは高い親和性があることが分かっていた。そこで、UvrA,UvrB,ATP,Mg存在下で複合体としての結晶化のスクリーニングを行い、微結晶を得た。UvrCについては全長での発現・精製方法を確立し、結晶化のスクリーニングを行ったが、良好な結晶が得られなかった。そこで、UvrCのプロテアーゼによる限定分解を行った。その結果を基に、いくつかのドメインに分割したUvrCフラグメントの発現プラスミドを作製し、その発現系を確立した。TRCFについては斜方晶系の結晶が得られ、SPring-8での回折パターンの測定により格子定数がa=76.63Å,b=141.45Å,c=310.03Å,α=β=γ=90°であることが分かった。V_mの値から非対称単位中含まれるTRCFは2〜4分子ある。UVによる傷害がどの様に遺伝子の転写に影響を与えるかを調べるために、高度好熱菌野生株およびuvrC破壊株にUVを照射し、照射前後での発現パターンの変化をDNA chipを用いて解析した。その結果、これまでに機能が知られていないconserved hypothetical proteinのいくつかがUVによって発現誘導されることが分かった。
核苷酸切除修复可以识别并去除各种DNA损伤,在细菌中至少涉及七种蛋白质:UvrA、UvrB、UvrC、UvrD、DNA连接酶、DNA聚合酶和转录修复偶联因子(TRCF)。到目前为止,我们已经单独分析了 UvrB 的 3D 结构,并通过 ATPase 活性测量确定 UvrA 和 UvrB 具有高亲和力。因此,我们在UvrA、UvrB、ATP和Mg存在下筛选复合物的结晶,并获得微晶。我们建立了UvrC的全长表达和纯化方法,并进行了结晶筛选,但没有获得好的晶体。因此,我们使用蛋白酶对 UvrC 进行了有限的降解。根据这些结果,我们创建了UvrC片段的表达质粒,分为多个结构域,并为其建立了表达系统。对于TRCF,获得了斜方晶体,通过SPring-8的衍射图测量确定其晶格常数为a=76.63 Å、b=141.45 Å、c=310.03 Å、α=β=γ=90°。发现了一些东西。从V_m的值来看,不对称单元中含有2至4个TRCF分子。为了研究紫外线引起的损伤如何影响基因转录,我们用紫外线照射野生嗜热细菌和 uvrC 破坏的菌株,并使用 DNA 芯片对照射前后表达模式的变化进行分析。结果,我们发现紫外线诱导了几种功能未知的保守假设蛋白的表达。

项目成果

期刊论文数量(0)
专著数量(0)
科研奖励数量(0)
会议论文数量(0)
专利数量(0)
Crystal structure of TTHA0252 from Thermus thermophilus HB8, a RNA degradation protein of the metallo-β-lactamase superfamily
  • DOI:
    10.1093/jb/mvj183
  • 发表时间:
    2006-10-01
  • 期刊:
  • 影响因子:
    2.7
  • 作者:
    Ishikawa, Hirohito;Nakagawa, Noriko;Masui, Ryoji
  • 通讯作者:
    Masui, Ryoji
高度好熱菌丸ごと一匹プロジェクト : 構造ゲノム科学からシステム生物学へ
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  • DOI:
  • 发表时间:
    2006
  • 期刊:
  • 影响因子:
    0
  • 作者:
    Ishikawa;H.;海老原章郎
  • 通讯作者:
    海老原章郎
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    2012
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    2000
  • 资助金额:
    $ 2.11万
  • 项目类别:
    Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
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