積層化マイクロ培養デバイスによる電気化学的遺伝子発現アッセイ

使用堆叠微培养装置进行电化学基因表达测定

基本信息

批准号：
17710112
负责人：
珠玖仁
金额：
$ 2.3万
依托单位：
Tohoku University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17710112/
关键词：
マイクロナノデバイス生体材料マイクロマシン細胞・組織

项目摘要

本研究では、3次元微細化工技術とソフトリソグラフィーの融合により、プラスミドアレイ、細胞アレイ、電極アレイを積層した積層型マイクロ培養デバイスを作製し、一連の遺伝子工学操作をオンチップで行うことを試みた。電気化学測定法の利点であるリアルタイム計測と定量性に着目し、遺伝子-タンパク質発現過程を詳細に追跡した。レポーターとしてべ一タ・ガラクトシダーゼ(βGAL)やアルカリホスファターゼ(AP)を用いた。1、Maltose Binding Protein (MBP)を標的とし、野生型および変異型MBPを発現ベクターを構築し、あらかじめMBPの下流に融合させたβGALの活性を指標として標的タンパク質の可溶性・不溶性を判定するデバイスを開発した。ウェスタンブロッティングによる発現状態との比較から、電流応答とMBPの可溶性発現量がよく対応していることが示された。最終的に電極-培養ウェルー体型デバイスを作製し、発現過程のリアルタイム計測に成功した。2、酵母Two-hybrid法を利用し、リガンド依存的な核内ホルモン受容体一転写制御因子の相互作用を電気化学的に評価した。17βエストラジオールをリガンドとする酵母Two-hybridシステムにおいて、リガンド濃度依存的にβGAL由来の電流応答増加を確認した。これにより、タンパク質問相互作用の電気化学的評価が微生物チップ上で可能であることが示された。3、ウェルアレイデバイスのデザインを改良し、各ウェルに単一微生物を捕捉する条件出しを検討した。単一微生物の培養、遺伝子発現、密閉ウェル内への代謝産物の蓄積に伴う蛍光計測などに成功した。昨年度開発したOn-chip遺伝子導入デバイスにおいても、プラスミドDNAおよびホスト大腸菌濃度を最適化することにより、1コロニー/ウェルが実現可能であることが示された。電極-ウェルー体型デバイスでは、細胞活性計測(酵母〜数細胞レベル)および電場制御に基づく細胞マニピュレーション(単一細胞(大腸菌・酵母)の導入・導出)に成功した。4、動物細胞培養株を用い、3次元培養デバイス上で細胞の極性・非極性を制御し、その培養速度の違いを呼吸活性に基づく電気化学応答として追跡することに成功した。代謝活性のみならずmRNAおよびタンパク質(サイトカイン)レベルでの活性評価にも成功した。

在本研究中，我们结合三维微加工技术和软光刻技术，创建了一种由质粒阵列、细胞阵列和电极阵列堆叠而成的堆叠式微培养装置，并尝试在芯片上进行一系列基因工程操作。 .着眼于电化学测量方法的实时测量和定量性能等优点，我们详细跟踪了基因-蛋白质的表达过程。使用β半乳糖苷酶（βGAL）和碱性磷酸酶（AP）作为报告基因。 1. 以麦芽糖结合蛋白（MBP）为靶标，构建野生型和突变型MBP的表达载体，并创建利用已融合在MBP下游的βGAL的活性来确定目标蛋白的可溶性或不溶性的装置，如开发的一个指标。与Western blotting测定的表达状态比较，电流反应与MBP可溶性表达水平吻合良好。最后，我们制作了电极培养孔式装置，并成功实现了表达过程的实时测量。 2.利用酵母双杂交方法，我们通过电化学方法评估了核激素受体和转录调节因子之间的配体依赖性相互作用。在使用 17β 雌二醇作为配体的酵母双杂交系统中，我们证实了 βGAL 衍生的电流响应以配体浓度依赖性方式增加。这表明在微生物芯片上对蛋白质-蛋白质相互作用进行电化学评估是可能的。 3.我们改进了孔阵列装置的设计，并研究了在每个孔中捕获单个微生物的条件。我们成功地培养了单一微生物、基因表达，并测量了与密封孔中代谢物积累相关的荧光。去年开发的芯片上基因转移装置表明，通过优化质粒DNA和宿主大肠杆菌浓度，可以实现一个菌落/孔。利用电极井型装置，我们成功测量了细胞活性（从酵母到多个细胞水平）和基于电场控制的细胞操作（引入和提取单细胞（大肠杆菌、酵母））。 4.利用动物细胞培养菌株，我们成功地控制了三维培养装置上细胞的极性和非极性，并跟踪培养速度的差异作为基于呼吸活动的电化学反应。我们不仅成功评估了代谢活性，还成功评估了 mRNA 和蛋白质（细胞因子）水平的活性。

项目成果

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专利数量（0）

Electrochemical screening of recombinant protein solubility in Escherichia coli using scanning electrochemical microscopy (SECM)

使用扫描电化学显微镜 (SECM) 电化学筛选重组蛋白在大肠杆菌中的溶解度

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
Biotechnol. Bioeng. 96・5
影响因子：
0
作者：
F.Okahara;K.Itoh;M.Ebihara;M.Kobayashi;H.Maruyama;Y.Kanaho;T.Maehama;Masaya Mitsuishi;Hiroshi Endo;Masaya Mitsuishi;M.Mitsuishi;K.Nagamine et al.
通讯作者：
K.Nagamine et al.

Cytokine assay on a cellar chip by combining collagen gel embedded culture with scanning electrochemical microscopy

通过胶原凝胶包埋培养与扫描电化学显微镜相结合在细胞芯片上进行细胞因子测定