石灰化促進・抑制機構を骨芽細胞と靭帯線維芽細胞を用いて探る

利用成骨细胞和韧带成纤维细胞探索促进和抑制钙化的机制

基本信息

批准号：
17689050
负责人：
吉澤達也
金额：
$ 17.56万
依托单位：
Niigata University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (A)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

申請者らは、石灰化の促進・抑制機構の解明を大きな目的とし、以下の解析を行った。(1)靭帯繊維芽細胞における石灰化抑制機構の解析申請者らのこれまでの研究により、靭帯細胞において、Integrin α7は機械的刺激依存的なFAKのリン酸化を抑える事により骨芽細胞様細胞への分化を抑制し、靭帯骨化を阻害する重要な因子であると考えられた。そこで、この靭帯線維芽細胞特異的なシグナル伝達機構を解明するため、鍵となる因子の単離を試みた。Integrin α7の細胞内ドメインにタグを付けたプラスミドを歯根膜細胞株L2に導入し、結合するタンパク質をプロテオミクスの手法により取得した。解析の結果、その因子はHSPファミリーの一つであった。siRNAを用いてこの因子の発現を抑制させ、機械的刺激をかけたが、石灰化促進には至らなかった。FAKのリン酸化抑制には違う因子が関与していると考えられた。(2)骨芽細胞における石灰化促進機構の解析申請者らは、ユビキチン関連酵素PIASxβの発現が、骨芽細胞の機械的刺激下で増加する事をDNAアレイ法によって見いだした。PIASxβは、E3 SUMO ligaseである。siRNAを用いて骨芽細胞株MC3T3-E1内でPIASxβの発現を抑制したところ、アルカリフォスファターゼ(ALP)の活性と石灰化が抑制された。その時、Runx2の発現は変わらなかったが、Osterix(OSX)の発現が顕著に抑制された。また、PIASxβの強制発現では、OSXやALP、オステオカルシンの発現が上昇した。ルシフェラーゼアッセイでは、OSXが自身のプロモーター活性を上昇させる事、そしてPIASxβがそれを促進する事を明らかにした。更に、NFATc1とNFATc3は、PIASxβと供発現させる事で、OSXの転写活性を促進させる事を明らかにした。この促進効果にはSUMO化が必須であるが、OSXにはSUMO化部位がない。したがって、SUMO化部位を持つ他の因子群が、PIASxβ依存的なOSX転写促進に関与していると考えられ、NFATがそのターゲットの一つであると示唆された。以上から、PIASxβは、骨芽細胞において、OSXの転写能とそれに引き続く石灰化に重要な役割を果たしていると結論づけられた。(3)靭帯線維芽細胞特異的遺伝子の単離と機能解析L2細胞特異的因子取得のため、L2細胞の表面抗体を作成した。更に、これらをFacsにより選別し、L2細胞に反応するが、MC3T3-E1細胞と筋芽細胞株C2C12には反応しないモノクローナル抗体を5クローン得た。これらを用いればL2細胞特異的因子の単離が可能と考えられるが、その因子の同定には至らなかった。

申请人进行了以下分析，主要目的是阐明钙化的促进和抑制机制。（1）根据过去对韧带纤维芽的分析申请人的研究，韧带细胞中的整联蛋白α7抑制机械刺激依赖性的磷酸化以抑制磷，这被认为是抑制分化和抑制韧带的重要因素。因此，为了阐明韧带奇特的信号传递机制，我们试图隔离关键因素。将具有整合素α7的细胞内结构域的质粒引入牙周羔羊细胞库存L2，并通过蛋白质组学方法获得结合蛋白。分析的结果是，该因素是HSP家族之一。使用siRNA，抑制了该因子的表达并应用了机械刺激，但没有促进钙化。据认为，抑制FAK磷酸化的不同因素。（2）骨头bun细胞中钙化促进机制的分析申请人发现，在骨膜细胞的机械刺激下，泛素相关酶PIASXβ的表达增加。 PIASXβ是E3 Sumo连接酶。使用siRNA抑制PIASXβ在骨细胞库存MC3T3-E1中的表达，抑制了碱性fatase（ALP）的活性和钙化。当时，Runx2的表达没有改变，但是Osterix（OSX）的表达很明显。在PIASXβ的强制表达中，OSX，ALP和骨内塞的表达增加。荧光素酶测定法指出，OSX会增加他的启动子活性，PIASXβ会促进它。此外，NFATC1和NFATC3阐明了通过用PIASXβ表达的OSX的转录活性。 Sumo对于这种促销效应至关重要，但是OSX没有相扑位点。因此，人们认为，与piasXβ依赖性OSX转移促进有关的其他因素与piasxβ涉及，这表明NFAT是目标之一。从上面的角度可以得出结论，PIASXβ在OSX的转移能力和钙化中起着重要作用，然后是无聊的细胞。（3）韧带接线成纤维细胞被创建为分离，功能分析L2细胞特异性因素。此外，这些是由FACS选择并对L2细胞做出反应的，但获得了5个单克隆抗体的克隆，这些抗体对MC3T3-E1细胞和肌肉细胞C2C12不反应。据认为，L2细胞特异性因素已解锁，但未鉴定该因子。