Gjb2コンディショナル・ノックアウトマウスの遺伝子導入による内耳の再生への挑戦

Gjb2条件性敲除小鼠基因转移对内耳再生的挑战

• 批准号: 17791202
• 负责人: 小笠原 香織
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791202/
• 关键词: Gjb2; ノックアウトマウス; コルチ器; アポトーシス

GJB2は1997年に発見された遺伝子で、ギャップジャンクション蛋白であるコネキシン26(CX26)をコードする遺伝子であり、難聴遺伝子の中で最も変異の頻度が高い遺伝子として注目を集めている。その動物モデルとしてgjb2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、その生理学的・形態学的解析を行った。Cre recombinase 存在下でgjb2遺伝子翻訳領域が切り取られるようにコンストラクトを作成した。ターゲッティングベクターはネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、二重選別法を用いて相同組換えを行い、ES細胞に2つのloxPサイトを導入した。このES細胞をC57BL6マウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作成し、C57BL6マウスと戻し交配を行いF1マウスを得た。組織特異的にCre recombinaseを持つトランスジエニックマウスとホモ接合体を交配させ、遺伝子欠失マウスを同定した。Cx26の免疫蛍光染色で、ヘテロ変異マウスではコルチ器の支持細胞、ラセン靭帯の線維細胞から血管条の基底細胞にかけて豊富に分布していたが、ホモ変異マウスで発現が全体的に低下していた。トーンバーストを用いたABRにての聴力検査ではヘテロ変異マウスはどの周波数(8,12,16,20kHz)でも聴力域値が30dB以下なのに対し、ホモ変異マウスは70〜80dBと高度の難聴を認めた。また、周波数ごとにホモ変異マウスとヘテロ変異マウスの差をとると、高周波数になるにつれ差が大きくなった。基底回転と第2回転においてホモ変異マウスのコルチ器は高度に変性していた。頂回転ではコルチ器の崩壊は認めたが、基底回転や第2回転ほど高度ではなかった。ABRにてホモ変異マウスはヘテロ変異マウスと比較して高周波数の聴力のほうが低下しており、HE染色の基底回転側が高度に崩壊している所見と一致した。ホモ変異マウスのコルチ器の透過電顕所見では、内有毛細胞は保たれているが、外有毛細胞は変形しており、1列に減少していた。また、コルチトンネルの崩壊を認めた。支持細胞にも著明な変形がみられた。血管条とらせん靭帯には明らかな異常は認めなかった。細胞死の原因としてアポトーシスの関与を考え、検討した。ホモ変異マウスのコルチ器にはTUNEL、Caspase-3ともに数個の陽性細胞を認め、アポトーシスの関与が示唆された。タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションについての免疫染色を検討した。ZO-1ではコルチ器、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現を認め、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな発現の差はみられなかった。また、血管条の基底細胞にも同様の発現を認めた。β-catenin、E-cadherinの染色で代表されるアドヘレンスジャンクションでは同様にコルチ器の内リンパ側、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現し、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな差は認めなかった。

GJB2是1997年发现的基因，是编码间隙连接蛋白连接蛋白26（CX26）的基因，并吸引了人们作为听力损失最常见的突变基因。作为动物模型，创建了有条件的敲除小鼠，并进行了生理和形态分析。创建构建体，以使GJB2基因翻译区域在存在CRE重组酶的情况下被截断。将靶向载体插入了新霉素耐药基因，使用双分配方法进行同源重组，并将两个LOXP位点引入ES细胞中。将这些ES细胞注射到C57BL6小鼠的胚泡中以产生嵌合小鼠，并用C57BL6小鼠反呼吸以获得F1小鼠。携带组织特异性CRE重组酶的跨跨小鼠与纯合子交叉，并鉴定出基因缺陷型小鼠。 CX26的免疫荧光染色表明，杂剂小鼠的分布大量分布于皮质器官的支撑细胞，螺旋韧带的纤维细胞与丝质血管质质基底细胞的纤维细胞，但在同生小鼠中通常会降低表达。在所有频率（8、12、16和20 kHz）的范围低于30 dB的范围，而同质小鼠的听力损失高70至80 dB。此外，当我们在每个频率下解释同性突变小鼠和异源小鼠之间的差异时，差异随较高的频率而增加。在基底和第二旋过程中，同源物小鼠中的皮质是高度变性的。在顶部旋转处观察到皮尔蒂机器的崩溃，但不如基底旋转或第二个旋转高。在ABR中，同源小鼠的高频听力低于异源小鼠，这与发现他染色的基础旋转一侧高度破坏的发现。同源物小鼠的皮质器官的渗透电子显微镜显示，内毛细胞被保留，但外毛细胞被变形并还原为一排。他还确认了Corti隧道的崩溃。在支撑细胞中也观察到显着的变形。在纹状体和螺旋韧带中未观察到明显的异常。细胞凋亡的参与被认为是细胞死亡的原因，并被检查。在TUNEL和CASPASE-3的同源物小鼠的Corti器官中发现了几个阳性细胞，这表明涉及凋亡。研究了针对紧密连接和依从性连接的免疫染色。在ZO-1中，在Corti器官，一部分边缘细胞和一部分螺旋侧表面观察到表达，在异源和同源物小鼠之间没有观察到表达的显着差异。在血管的基底细胞中也观察到了相似的表达。在以β-catenin和e-钙粘蛋白染色为代表的依从性连接中，它们在Corti器官的内淋巴侧类似地表达，某些边缘细胞和一些螺旋侧面表面，并且在异源和唯物小鼠之间也没有观察到显着差异。