Gjb2コンディショナル・ノックアウトマウスの遺伝子導入による内耳の再生への挑戦

Gjb2条件性敲除小鼠基因转移对内耳再生的挑战

• 批准号: 17791202
• 负责人: 小笠原 香織
• 金额: $ 2.11万
• 依托单位: Juntendo University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17791202/
• 关键词: Gjb2; ノックアウトマウス; コルチ器; アポトーシス

GJB2は1997年に発見された遺伝子で、ギャップジャンクション蛋白であるコネキシン26(CX26)をコードする遺伝子であり、難聴遺伝子の中で最も変異の頻度が高い遺伝子として注目を集めている。その動物モデルとしてgjb2コンディショナルノックアウトマウスを作成し、その生理学的・形態学的解析を行った。Cre recombinase 存在下でgjb2遺伝子翻訳領域が切り取られるようにコンストラクトを作成した。ターゲッティングベクターはネオマイシン耐性遺伝子を挿入し、二重選別法を用いて相同組換えを行い、ES細胞に2つのloxPサイトを導入した。このES細胞をC57BL6マウスの胚盤胞へ注入してキメラマウスを作成し、C57BL6マウスと戻し交配を行いF1マウスを得た。組織特異的にCre recombinaseを持つトランスジエニックマウスとホモ接合体を交配させ、遺伝子欠失マウスを同定した。Cx26の免疫蛍光染色で、ヘテロ変異マウスではコルチ器の支持細胞、ラセン靭帯の線維細胞から血管条の基底細胞にかけて豊富に分布していたが、ホモ変異マウスで発現が全体的に低下していた。トーンバーストを用いたABRにての聴力検査ではヘテロ変異マウスはどの周波数(8,12,16,20kHz)でも聴力域値が30dB以下なのに対し、ホモ変異マウスは70〜80dBと高度の難聴を認めた。また、周波数ごとにホモ変異マウスとヘテロ変異マウスの差をとると、高周波数になるにつれ差が大きくなった。基底回転と第2回転においてホモ変異マウスのコルチ器は高度に変性していた。頂回転ではコルチ器の崩壊は認めたが、基底回転や第2回転ほど高度ではなかった。ABRにてホモ変異マウスはヘテロ変異マウスと比較して高周波数の聴力のほうが低下しており、HE染色の基底回転側が高度に崩壊している所見と一致した。ホモ変異マウスのコルチ器の透過電顕所見では、内有毛細胞は保たれているが、外有毛細胞は変形しており、1列に減少していた。また、コルチトンネルの崩壊を認めた。支持細胞にも著明な変形がみられた。血管条とらせん靭帯には明らかな異常は認めなかった。細胞死の原因としてアポトーシスの関与を考え、検討した。ホモ変異マウスのコルチ器にはTUNEL、Caspase-3ともに数個の陽性細胞を認め、アポトーシスの関与が示唆された。タイトジャンクションとアドヘレンスジャンクションについての免疫染色を検討した。ZO-1ではコルチ器、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現を認め、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな発現の差はみられなかった。また、血管条の基底細胞にも同様の発現を認めた。β-catenin、E-cadherinの染色で代表されるアドヘレンスジャンクションでは同様にコルチ器の内リンパ側、辺縁細胞の一部、ラセン板縁表面の一部に発現し、ヘテロ変異マウスとホモ変異マウスに大きな差は認めなかった。

GJB2是1997年发现的编码间隙连接蛋白连接蛋白26（CX26）的基因，作为听力损失基因中突变率最高的基因而受到关注。我们建立了gjb2条件敲除小鼠作为动物模型，并分析了其生理和形态特征。创建了一个构建体，以便在 Cre 重组酶存在的情况下切除 gjb2 基因翻译区。将新霉素抗性基因插入打靶载体中，采用双选择方法进行同源重组，并将两个loxP位点引入ES细胞中。将这些ES细胞注射到C57BL6小鼠的囊胚中以产生嵌合小鼠，将其与C57BL6小鼠回交以获得F1小鼠。我们将转基因小鼠与组织特异性 Cre 重组酶和纯合子杂交，以鉴定基因缺陷小鼠。免疫荧光染色显示，Cx26在杂合突变小鼠的柯蒂氏器支持细胞、螺旋韧带纤维细胞和血管纹基底细胞中大量分布，但在纯合突变小鼠中表达总体下降。在使用 ABR 使用突发音进行的听力测试中，杂合突变小鼠在所有频率（8、12、16 和 20 kHz）下的听力阈值为 30 dB 或更低，而纯合突变小鼠的听力严重损失为 70 至 80分贝。此外，当我们计算每个频率的纯合子和杂合子突变小鼠之间的差异时，随着频率的升高，差异变得更大。纯合突变小鼠的柯蒂氏器官在基础轮转和第二次轮转中高度退化。在顶端旋转时观察到柯蒂氏器塌陷，但不如基部旋转和第二旋转严重。在ABR中，纯合突变小鼠的高频听力低于杂合突变小鼠，这与HE染色的基础旋转侧被高度破坏的发现一致。纯合突变小鼠柯蒂氏器的透射电镜观察结果显示，内毛细胞得以保留，但外毛细胞变形并减少为单排。还证实科尔蒂隧道已经塌陷。在支持细胞中也观察到显着变形。血管纹及螺旋韧带未见明显异常。我们考虑并研究了细胞凋亡作为细胞死亡原因的参与。在纯合突变小鼠的 Corti 器官中观察到一些 TUNEL 和 Caspase-3 均呈阳性的细胞，表明细胞凋亡的参与。检查了紧密连接和粘附连接的免疫染色。 ZO-1在柯蒂氏器、部分边缘细胞和部分螺旋板周边表面表达，杂合子和纯合子突变小鼠之间的表达没有观察到大的差异。在血管纹的基底细胞中也观察到类似的表达。在粘附连接处，以β-连环蛋白和E-钙粘蛋白染色为代表，它们在柯蒂氏器的内淋巴侧、一些边缘细胞和螺旋板边缘的部分表面上类似地表达，并且与杂合突变小鼠中没有观察到重大差异。