ムチン型糖転移酵素遺伝子の単離と解析

粘蛋白型糖基转移酶基因的分离与分析

• 批准号: 17790233
• 负责人: 橋本 光義
• 金额: $ 0.77万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17790233/
• 关键词: 糖転移酵素; ムチン; acetylglucosaminyltransferase; 免疫染色; ノーザンプロット; RACE

マウスcore2 β1,6-N-acetylglucosaminyltransferase mucus type(C2GnT-M)遺伝子をクローニングするために、ヒトC2GnT-M遺伝子のcDNA塩基配列を用いてデータベース検索を行った。次に、マウスの大腸からmRNAを抽出し、RACE法を用いてC2GnT-M遺伝子のcDNAを取得した。5'-RACEでは1種類、3'-RACEでは2種類のcDNA断片が得られた。マウスC2GnT-MのmRNAは2種類あると考えられ、その完全長塩基配列は約4.3kbおよび2.25kbであった。DNA塩基配列との比較により、C2GnT-M遺伝子は3つのexonで構成され、そのopen reading frameはexon3に位置しており、2つの異なるポリA付加部位を使用していることが示唆された。RACEプロダクトの一部をプローブにしてノーザンプロット法を行ったところ、2本のバンドが確認され、大腸や小腸、胃に強い発現が認められた。次に、合成ペプチドを用いてポリクローナル抗体の作製を行った。抗体の検定は、ウエスタンブロット法を用いて行った。C2GnT-Mの触媒領域をPCRクローニングにより発現ベクターに組み込み、Panc1細胞にトランスフェクションしてFLAGタグとの融合タンパク質を発現させ、抗体の特異性を確認した。免疫染色によりC2GnT-Mは、大腸の杯細胞、小腸の杯細胞やパネート細胞、ブルンナー腺、胃の腺窩上皮、副細胞、幽門腺に発現が認められた。C2GnT-Mは、MUC2やMUC5AC、MUC6などの分泌型ムチンを分泌する細胞に発現していることが示唆された。以上の内容は英語論文にまとめ現在投稿中である。また、ヒト大腸癌におけるC2GnT-Mの発現を免疫染色により検討したところ、分化型腺癌では発現が低下しているが粘液癌には強い発現が認められた。

为了克隆小鼠Core2β1,6-N-乙酰葡萄糖氨基转移酶粘液类型（C2GNT-M）基因，使用人C2GNT-M基因的CDNA碱基序列进行了数据库搜索。接下来，从小鼠的大肠中提取mRNA，并使用种族方法获得了C2GNT-M基因的cDNA。获得了一种类型的5'-Race cDNA片段，并获得了两种类型的cDNA片段。小鼠C2GNT-M有两种类型的mRNA，其全长核苷酸序列约为4.3 kb和2.25 kb。与DNA碱基序列的比较表明，C2GNT-M基因由三个外显子组成，其开放式阅读框使用Exon3，使用两个不同的Polya添加位点。当将一部分种族产品用作探针时，确认了两个条带，并在大肠，小肠和胃中观察到强烈的表达。接下来，使用合成肽制备多克隆抗体。使用蛋白质印迹分析抗体。通过PCR克隆将C2GNT-M的催化区域掺入表达载体中，并转染PANC1细胞以用标记标记表达融合蛋白，从而确认抗体的特异性。免疫染色表明，在小肠，小肠，布鲁纳的腺体，胃隐层上皮，反细胞和幽门腺中，C2GNT-M在大肠，杯状和摇齿细胞中的杯状细胞中表达。有人提出，C2GNT-M在分泌分泌的粘蛋白（如MUC2，MUC5AC和MUC6）的细胞中表达。以上是在英文论文中总结的，目前正在提交。此外，当通过免疫染色检查人类结肠癌中C2GNT-M的表达时，在分化的腺癌中降低了表达，但在粘液癌中观察到了强烈的表达。