RNA分解酵素によるsiRNAの切断様式の解明とそれに基づく安定化修飾法の開発

阐明RNA降解酶对siRNA的切割模式并开发基于此的稳定化修饰方法

基本信息

批准号：
17790185
负责人：
武井佳史
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

项目摘要

3'インバート・チミジン基修飾siRNAの各RNA分酵素に対する耐性の検討RNA interference(RNAi)は2本鎖RNAがその相補的な配列を持つ遺伝子の発現を特異的に抑制する現象である。RNAiによる遺伝子サイレンシングはその配列特異性と発現抑制効果が非常に高く、癌やエイズなどの難治性疾患に対する臨床応用が期待されている。しかし、RNAiを誘導するsiRNA分子は動物に投与した場合、非常に分解されやすい。siRNA分子自体を医薬品のシーズとして臨床応用するためには、生体内環境でsiRNA分子自身を安定化させることが必要不可欠である。そこで、siRNA分子の3'オーバーハングの1個のデオキシチミジン基をインバート・デオキシチミジン基(以下Inv.T基)に置換したInv.T修飾siRNA(Inv.T siRNA)を昨年度までに合成した。今年度は上記Inv.T siRNAの各種RNA分解酵素に対する耐性をPAGE法にて検討し、以下に示す新規知見を得た。対象酵素はRNaseS1,Phosphodiesterase I, RNase P1,RNase HおよびRNase Aの5種とした。(1)RNase S1と反応させると、Inv.T siRNAは未修飾siRNAとほぼ同等に消化された。生成した消化フラグメントRNAもほぼ同じであった。本酵素は小RNAに対して、エンドヌクレアーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を示した。(2)Phosphodiesterase Iと反応させると、Inv.T siRNAは未修飾siRNAと比べて強い耐性を示した。本酵素は小RNAに対して、エキソヌクレアーゼ活性のみを示した。Inv.T siRNAは、エキソヌクレアーゼ活性を示す分解酵素に対して、とても有効な安定化修飾法であった。(3)Inv.T siRNAと未修飾siRNAはRNase P1,RNase HおよびRNase Aに対してほぼ同等の酵素耐性を示した。各酵素の基質特異性はRNase P1(1本鎖RNA)、RNase H(DNA-RNAハイブリッド鎖)、RNase A(1本鎖RNA)であり、小RNA分子に対してもこの基質特異性が保持されていた。【結論】siRNA分子を安定化する為には、RNA分解酵素群のエンドヌクレーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性の両方を抑える必要がある。特にエンドヌクレアーゼ活性を抑える必要性を証明した。

检查3'反向胸苷基团修饰的siRNA对各种RNA消化酶的抗性RNA干扰(RNAi)是双链RNA与其互补序列特异性抑制基因表达的现象。 RNAi基因沉默具有极高的序列特异性和表达抑制作用，有望在癌症、艾滋病等疑难疾病方面有临床应用。然而，诱导 RNAi 的 siRNA 分子在给予动物时非常容易被降解。为了将siRNA分子本身作为药物种子应用于临床，必须使siRNA分子本身在体内环境中稳定。因此，去年我们合成了Inv.T修饰的siRNA（Inv.T siRNA），其中siRNA分子3'突出端的一个脱氧胸苷基团被反向脱氧胸苷基团取代（以下简称Inv.T）团体）。今年，我们利用PAGE方法研究了上述Inv.T siRNA对各种RNA降解酶的抗性，并获得了以下新发现。目标酶是 RNase S1、磷酸二酯酶 I、RNase P1、RNase H 和 RNase A。 (1) 当与 RNase S1 反应时，Inv.T siRNA 几乎与未修饰的 siRNA 一样被消化。生成的消化片段RNA也几乎相同。该酶对小 RNA 表现出核酸内切酶和核酸外切酶活性。 (2)当与磷酸二酯酶I反应时，Inv.T siRNA比未修饰的siRNA表现出更强的抗性。该酶仅表现出针对小 RNA 的核酸外切酶活性。 Inv.T siRNA 是一种非常有效的稳定修饰方法，用于降解具有核酸外切酶活性的酶。 (3) Inv.T siRNA和未修饰的siRNA对RNase P1、RNase H和RNase A表现出几乎相同的酶抗性。每种酶的底物特异性是RNase P1（单链RNA）、RNase H（DNA-RNA杂合链）和RNase A（单链RNA），并且即使对于小RNA分子也保持这种底物特异性。到过。 [结论]为了稳定siRNA分子，需要同时抑制RNA降解酶的核酸内切酶和核酸外切酶活性。特别是，证明了抑制核酸内切酶活性的必要性。

项目成果

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Midkine antisense oligodeoxynucleotide inhibits renal damage induced by ischemic reperfusion

中期因子反义寡聚脱氧核苷酸抑制缺血再灌注引起的肾损伤

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Kidney International Vol.67 No.4
影响因子：
0
作者：
Sato W;Takei Y;Yuzawa Y;Matsuo S;Kadomatsu K;Muramatsu T
通讯作者：
Muramatsu T

Antisense oligodeoxynucleotide as to the growth factor midkine suppresses neointima formation induced by balloon injury

生长因子中期因子的反义寡脱氧核苷酸抑制球囊损伤诱导的新内膜形成

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
American Journal of Physiology -Heart and Circulatory Physiology Vol.288 No.5
影响因子：
0
作者：
Hayashi K;Banno H;Kadomatsu K;Takei Y;Komori K;Muramatsu T
通讯作者：
Muramatsu T

Growth factor midkine is involved in the pathogenesis of diabetic nephropathy