単一皮膚感覚受容器の刺激感受性と発現遺伝子の並列的解析による細胞特異的因子の同定

通过平行分析单一皮肤感觉受体的刺激敏感性和表达基因来识别细胞特异性因素

基本信息

批准号：
17790159
负责人：
片野坂公明
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Nagoya University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

项目摘要

本研究では、「生体単一細胞の生理機能分類」と「発現遺伝子に基づく細胞タイプの分類」とを対応づける手法の確立を目的とし、その第一段階として、生体DRGでの単一神経細胞の電気生理学的記録を試みた。平成19年度は以下の研究を実施した。1、生体ラットを用いたin vivoパッチクランプ法による単一DRG細胞応答の記録昨年度に引き続き、麻酔下ラット腰部脊髄後根神経節(DRG)からの単一感覚神経細胞の全細胞記録の確立を目指した。まず、皮膚を支配する神経細胞を他と区別して標識するために、実験に用いる動物の皮膚に蛍光色素DiIを注入し、逆行性標識に適した条件を決定した。これまでに百例に近い手術を行ない、座骨神経およびその末梢受容野との神経連絡を保ったまま腰部DRGを体外へ導出した標本の作成にはほぼ成功した。この標本を用いて、一昨年度に構築したin vivoパッチクランプ実験装置により、DRGからの全細胞記録方法を行うための手法と装置の改良を行った。このステップでは、昨年度、顕微鏡下での微細操作時にDRGからの赤血球の漏出による視野の悪化が最大の問題点であったため、酵素処理条件(酵素濃度、投与時間、投与圧、流速、酵素の回収方法等)と、出血の防止方法(血管収縮剤、止血剤等の添加)を検討した。血液凝固剤は血球の大きな凝集により視野を悪化させたが、血流を完全には抑えない程度の低容量のノルアドレナリンにより出血傾向は改善した。その他様々な改良により、微細操作の効率と細胞の状態が改善され、数例において神経細胞への良好な電極の接触(ギガシール)が可能であったが、安定して良好な細胞を得ることは難しく、神経活動の記録には到らなかった。2、培養DRG細胞での温度・機械応答の記録および発現する受容体のsingle cell RT-PCR解析上記において、単一細胞からの記録に成功しなかったため本解析は実施していない。

在这项研究中，我们旨在建立一种将“单细胞生物细胞的生理分类”与“基于表达基因的细胞类型的分类”相关的方法，并且第一步是对生物DRG中的单细胞神经元进行电生理记录。 2007年，进行了以下研究。 1。在去年，在活体大鼠中通过体内贴片夹方法记录单个DRG细胞响应，我们的目的是在麻醉大鼠下从腰椎背脊髓的背根神经节（DRG）中建立单个感官神经元的全细胞记录。首先，为了区分和标记控制皮肤与其他皮肤的神经细胞，向实验中使用的动物皮肤注入了荧光染料DII，并确定了适合逆行标记的条件。到目前为止，我们已经进行了近100例手术病例，几乎成功地创建了从体外衍生出腰椎DRG的标本，同时与坐骨神经及其外周接受场保持神经通信。使用此标本，我们使用两年前构建的体内贴片夹实验设备改进了从DRG执行整个细胞记录方法的方法和设备。在此步骤中，最大的问题是，由于显微镜操作期间，由于DRG从DRG中渗出，视野正在恶化，因此我们研究了酶处理条件（酶浓度，给药时间，给药时间，给药时间，流动压力，流量，酶恢复方法等）和防止囊泡的方法（添加囊泡剂，等等，等等，等等，等等。血液凝血剂由于血细胞的大量聚集而导致视野恶化，但由于甲肾上腺素量较低而导致的出血趋势改善了，这并没有完全抑制血液流动。其他各种改进提高了精细操纵和细胞状况的效率，在某些情况下使良好的电极接触（GIGASEAL）可以到神经细胞，但是很难获得稳定和良好的细胞，并且尚未达到神经活动的记录。 2。记录培养的DRG细胞中的温度和机械响应以及上述表达受体的单细胞RT-PCR分析，因此没有进行该分析，因为单个细胞的记录不成功。