アノマー反転型糖加水分解酵素のグライコシンターゼ化

异头反向糖基水解酶的糖合酶转化

• 批准号: 17780086
• 负责人: 本多 裕司
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Ishikawa Prefectural University (2006-2007)National Food Research Institute (2005)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780086/
• 关键词: グライコシンターゼ; 糖加水分酵素; 糖加水分解酵素; アノマー反転型; ランダム変異

一般的に,糖加水分解酵素は反応機構の違いから,「アノマー保持型酵素」と「アノマー反転型酵素」の2種に大別される。アノマー保持型酵素は糖転移反応も触媒することから,糖鎖合成のツールとして用いられている。さらに,アノマー保持型酵素は求核基を不活性化させることで加水分解能を消失させた変異型酵素と反対側のアノマー型のフッ化オリゴ糖を基質に用いて合成反応のみを触媒する,いわゆる「グライコシンターゼ化」した研究例も報告されている。一方,アノマー反転型酵素は糖転移反応を全く触媒せず,用途が分解反応に限られていた。また,アノマー反転型酵素の不活性型酵素とフッ化糖を組み合わせた上記のグライコシンターゼ化の研究も全く行われていなかった。2006年にアノマー反転型酵素であるRex(Bacillus halodurans C-125由来還元末端オリゴキシラナーゼ)にランダム変異を導入して,グライコシンターゼ化することに成功した。ところが,これらの変異型酵素はフッ素遊離能が野生型酵素よりも低下しているとともに,微弱な加水分解活性が残存していた。アノマー反転型GHのグライコシンターゼ反応を高効率化するには,フッ素遊離能を落とさずに,加水分解活性を低下させる変異導入が重要な鍵となる。グライコシンターゼ反応の高効率化を目指して,新たなRexの変異型酵素を設計し酵素活性を解析した。活性部位近傍のY198をFに置換した変異型酵素が効率よくグライコシンターゼ反応を触媒することが判明した。アノマー反転型GHをグライコシンターゼ化する場合は,求核試薬である水分子を保持する一般塩基触媒残基以外の残基に変異を導入することが有効であると結論した。

一般来说，根据反应机制的不同，糖基水解酶分为“端基异构体保留酶”和“端基异构体逆转酶”两种。端基保留酶也催化转糖基化反应，因此被用作糖链合成的工具。此外，异头保留酶仅催化使用异头氟化寡糖作为底物的合成反应，这与通过失活亲核基团而失去水解能力的突变酶相反，也有“糖合酶转化”的研究案例。被举报。另一方面，异头转化酶根本不催化转糖基反应，并且它们的用途仅限于分解反应。此外，还没有对使用非活性形式的异头反向酶和氟化糖的上述糖合酶组合进行研究。 2006年，我们通过在异头反转酶中引入随机突变，成功地将Rex（源自盐芽孢杆菌C-125的还原末端寡聚木聚糖酶）转化为糖合酶。然而，这些突变酶的氟释放能力低于野生型酶，并且仍然具有弱水解活性。为了提高异头反向GH的糖合酶反应效率，关键是引入降低水解活性而不降低氟释放能力的突变。为了提高糖合酶反应的效率，我们设计了一种新的Rex突变酶并分析了其酶活性。研究发现，活性位点附近的Y198被F取代的突变酶可有效催化糖合酶反应。我们得出的结论是，当将异头反向GH转化为糖合酶时，将突变引入到保留水分子的一般碱基催化残基以外的残基中是有效的，水分子是亲核试剂。

项目成果

A reducing-end-acting chitinase from Vibrio proteolyticus belonging to glycoside hydrolase family 19

• DOI: 10.1007/s00253-008-1352-2
• 发表时间: 2008-03-01
• 期刊: APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
• 影响因子: 5
• 作者: Honda, Yuji;Taniguchi, Hajime;Kitaoka, Motomitsu
• 通讯作者: Kitaoka, Motomitsu

Alternative strategy for converting an inverting glycoside hydrolase into a glycosynthase

• DOI: 10.1093/glycob/cwn011
• 发表时间: 2008-04-01
• 期刊: GLYCOBIOLOGY
• 影响因子: 4.3
• 作者: Honda, Yuji;Fushinobu, Shinya;Kitaoka, Motomitsu
• 通讯作者: Kitaoka, Motomitsu

The first glycosynthase derived from an inverting glycoside hydrolase

• DOI: 10.1074/jbc.m511202200
• 发表时间: 2006-01-20
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Honda, Y;Kitaoka, M
• 通讯作者: Kitaoka, M