アノマー反転型糖加水分解酵素のグライコシンターゼ化

异头反向糖基水解酶的糖合酶转化

• 批准号: 17780086
• 负责人: 本多 裕司
• 金额: $ 1.92万
• 依托单位: Ishikawa Prefectural University (2006-2007)National Food Research Institute (2005)
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780086/
• 关键词: グライコシンターゼ; 糖加水分酵素; 糖加水分解酵素; アノマー反転型; ランダム変異

一般的に,糖加水分解酵素は反応機構の違いから,「アノマー保持型酵素」と「アノマー反転型酵素」の2種に大別される。アノマー保持型酵素は糖転移反応も触媒することから,糖鎖合成のツールとして用いられている。さらに,アノマー保持型酵素は求核基を不活性化させることで加水分解能を消失させた変異型酵素と反対側のアノマー型のフッ化オリゴ糖を基質に用いて合成反応のみを触媒する,いわゆる「グライコシンターゼ化」した研究例も報告されている。一方,アノマー反転型酵素は糖転移反応を全く触媒せず,用途が分解反応に限られていた。また,アノマー反転型酵素の不活性型酵素とフッ化糖を組み合わせた上記のグライコシンターゼ化の研究も全く行われていなかった。2006年にアノマー反転型酵素であるRex(Bacillus halodurans C-125由来還元末端オリゴキシラナーゼ)にランダム変異を導入して,グライコシンターゼ化することに成功した。ところが,これらの変異型酵素はフッ素遊離能が野生型酵素よりも低下しているとともに,微弱な加水分解活性が残存していた。アノマー反転型GHのグライコシンターゼ反応を高効率化するには,フッ素遊離能を落とさずに,加水分解活性を低下させる変異導入が重要な鍵となる。グライコシンターゼ反応の高効率化を目指して,新たなRexの変異型酵素を設計し酵素活性を解析した。活性部位近傍のY198をFに置換した変異型酵素が効率よくグライコシンターゼ反応を触媒することが判明した。アノマー反転型GHをグライコシンターゼ化する場合は,求核試薬である水分子を保持する一般塩基触媒残基以外の残基に変異を導入することが有効であると結論した。

通常，由于反应机制的差异，糖醇液化酶可以大致分为两种类型：“抗厌氧酶的酶”和“抗逆转酶”。隔离酶还可以催化糖基化反应，并用作糖基化合成的工具。此外，有报道称，研究案例，其中一种抗蛋白酶的酶仅通过在突变酶的另一侧使用氟化寡糖来催化合成反应，而突变酶的另一侧通过失去核无亲核体而失去其水解的突变酶。另一方面，异脑反相酶完全不会催化糖基化反应，其使用仅限于分解反应。此外，没有对上述糖合酶形成的研究，结合了一种异常反转酶和荧光糖的无活性酶。在2006年，将随机突变引入了反转酶REX（还原源自Halodurans c-125的末端寡氧基酶），并成功地转化为糖合酶。然而，这些突变酶的氟释放能力低于野生型酶，并且弱水解活性仍然存在。为了提高异构体融合GH的糖合酶反应的效率，降低了降低水解活性而不降低氟释放能力的诱变是重要的关键。为了提高糖合酶反应的效率，设计了一种新的REX突变酶，并分析了酶活性。发现一种突变酶，在该突变酶被F用F取代的Y198用F替换为F糖合酶反应有效地催化。得出的结论是，当将Anomeric倒置GH转化为糖合酶时，将突变引入突变时，除了携带水分子的一般碱基催化的残基（一种是核粒的）是有效的。

项目成果

A reducing-end-acting chitinase from Vibrio proteolyticus belonging to glycoside hydrolase family 19

• DOI: 10.1007/s00253-008-1352-2
• 发表时间: 2008-03-01
• 期刊: APPLIED MICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY
• 影响因子: 5
• 作者: Honda, Yuji;Taniguchi, Hajime;Kitaoka, Motomitsu
• 通讯作者: Kitaoka, Motomitsu

Alternative strategy for converting an inverting glycoside hydrolase into a glycosynthase

• DOI: 10.1093/glycob/cwn011
• 发表时间: 2008-04-01
• 期刊: GLYCOBIOLOGY
• 影响因子: 4.3
• 作者: Honda, Yuji;Fushinobu, Shinya;Kitaoka, Motomitsu
• 通讯作者: Kitaoka, Motomitsu

The first glycosynthase derived from an inverting glycoside hydrolase

• DOI: 10.1074/jbc.m511202200
• 发表时间: 2006-01-20
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Honda, Y;Kitaoka, M
• 通讯作者: Kitaoka, M