AODアイソザイムを用いた新規異種発現系の開発と発現タンパク質の細胞内局在の制御

使用 AOD 同工酶开发新型异源表达系统并控制表达蛋白的亚细胞定位

基本信息

批准号：
17780065
负责人：
中川智行
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780065/
关键词：
Pichia methanolica Alcohol oxidase Isozyme Peroxisome Mitochondria Expression system Gene expression system

项目摘要

本研究課題は、メチロトローフ酵母Pichia methanolicaの2種のアルコールオキシダーゼ(AOD)遺伝子プロモータを利用した新規異種遺伝子発現系の確立を目的としている。昨年度、申請者は同一細胞内で複数の有用タンパク質の発現量比・発現時期をメタノールおよび酸素濃度により自在にコントロールできる2種のAOD遺伝子プロモータを利用した異種遺伝子発現系を開発した。本年度は発現タンパク質の細胞内局在の制御の可能性について検討した。AODアイソザイムがペルオキシソーム(Ps)局在であることから、AODの細胞内輸送機構を応用して発現タンパク質をPsに集積させることが可能であると考えられる。そこでAODアイソザイムの細胞内輸送制御機構の解明、さらには発現タンパク質のPs選択的輸送について検討した。まず、AODアイソザイムのPs輸送体と考えられるPex5pの一次構造とその欠損株の表現型について解析を行った。Pex5欠損株ではAODなどPs局在型メタノール代謝酵素がPsには輸送されていなかった。つまり、Ps局在型メタノール代謝酵素はPex5pを介して輸送されており、Pex5pが認識するシグナル配列PTS1が異種発現タンパク質のPs輸送に最適であると結論付けた。そこで、PTS1を付与したGFPをAODプロモータにて発現させ、その細胞内局在を観察した。その結果、GFPは効率的にPsへ輸送され、Pex5欠損株ではPs輸送は観察されなかった。また、ミトコンドリアのタンパク質内膜輸送に関与するTim9の構造についても明らかにした。これらの結果は、2種のAODプロモータを利用した異種遺伝子発現系において発現タンパク質をPsに特異的に蓄積できることを示しており、P.methanolicaの新規異種遺伝子発現系を確立することができたものと考えている。

该研究主题旨在使用甲基营养酵母pichia甲基甲基菌的两种类型的酒精氧化酶（AOD）基因启动子建立一种新型的异源基因表达系统。去年，申请人使用两个AOD基因启动子开发了一个异源基因表达系统，该基因启动子允许同一细胞中多种有用蛋白的表达比和时间安排由甲醇和氧气浓度自由控制。今年，我们调查了控制表达蛋白质的亚细胞定位的可能性。由于AOD同工酶位于过氧化物酶体（PS）上，因此人们认为可以通过应用AOD的细胞内转运机理组装PS中表达的蛋白质。因此，我们研究了控制AOD同工酶细胞内转运的机制，以及表达蛋白的PS的选择性转运。首先，我们分析了PEX5P的主要结构，PEX5P被认为是AOD同工酶的PS转运蛋白和缺陷菌株的表型。在缺乏PEX5的菌株中，未将无PS定位的甲醇代谢酶（如AOD）转运到PS。换句话说，通过PEX5P运输PS-定位的甲醇金代谢酶，我们得出的结论是，PEX5P识别的信号序列PTS1对于异源表达蛋白的PS转运是最佳的。因此，使用AOD启动子表示给出PTS1的GFP，并观察到其亚细胞定位。结果，GFP有效地运输到PS，并且在PEX5缺陷菌株中未观察到PS转运。我们还阐明了TIM9的结构，该结构参与了线粒体蛋白质亲切转运。这些结果表明，可以使用两个AOD启动子在异源基因表达系统中特异性地积累表达的蛋白质，我们认为可以建立一种新型的异源基因表达系统。

项目成果

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Peroxisomal metabolism is regulated by oxygen-recognition system through the organelle-crosstalk between mitochondria and peroxisomes.

过氧化物酶体代谢由氧识别系统通过线粒体和过氧化物酶体之间的细胞器串扰来调节。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
Yeast 24(In press)
影响因子：
0
作者：
Fujimura S;Nakagawa T;Ito T;Matsufuji Y;Miyaji T;Tomizuka N
通讯作者：
Tomizuka N

Molecular Characterization of the PEX5 gene Encoding Peroxisomal Targeting Signal 1 Receptor from the Methylotrophic Yeast Pichia methanolica.

编码来自甲基营养酵母甲醇毕赤酵母的过氧化物酶体靶向信号 1 受体的 PEX5 基因的分子特征。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
Yeast 24(In press)
影响因子：
0
作者：
Ito T;Fujimura S;Matsufuji Y;Miyaji T;Nakagawa T;Tomizuka N
通讯作者：
Tomizuka N

Pectin utilization by methylotrophic yeast Pichia methanolica.

甲基营养酵母甲醇毕赤酵母对果胶的利用。

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Microbiology 151(6)
影响因子：
0
作者：
Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.
通讯作者：
Nakagawa T et al.

Molecular characterization of the Tim9 homologue from the methylotrophic yeast Pichia methanolica.

来自甲基营养酵母甲醇毕赤酵母的 Tim9 同源物的分子特征。

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Yeast 23(9)
影响因子：
0
作者：
Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N
通讯作者：
Tomizuka N

Current Topics in Biochemistry

生物化学当前话题

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
影响因子：
0
作者：
Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.
通讯作者：
Nakagawa T et al.