AODアイソザイムを用いた新規異種発現系の開発と発現タンパク質の細胞内局在の制御

使用 AOD 同工酶开发新型异源表达系统并控制表达蛋白的亚细胞定位

基本信息

批准号：
17780065
负责人：
中川智行
金额：
$ 2.18万
依托单位：
Tokyo University of Agriculture
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2006
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780065/
关键词：
Pichia methanolica Alcohol oxidase Isozyme Peroxisome Mitochondria Expression system Gene expression system

项目摘要

本研究課題は、メチロトローフ酵母Pichia methanolicaの2種のアルコールオキシダーゼ(AOD)遺伝子プロモータを利用した新規異種遺伝子発現系の確立を目的としている。昨年度、申請者は同一細胞内で複数の有用タンパク質の発現量比・発現時期をメタノールおよび酸素濃度により自在にコントロールできる2種のAOD遺伝子プロモータを利用した異種遺伝子発現系を開発した。本年度は発現タンパク質の細胞内局在の制御の可能性について検討した。AODアイソザイムがペルオキシソーム(Ps)局在であることから、AODの細胞内輸送機構を応用して発現タンパク質をPsに集積させることが可能であると考えられる。そこでAODアイソザイムの細胞内輸送制御機構の解明、さらには発現タンパク質のPs選択的輸送について検討した。まず、AODアイソザイムのPs輸送体と考えられるPex5pの一次構造とその欠損株の表現型について解析を行った。Pex5欠損株ではAODなどPs局在型メタノール代謝酵素がPsには輸送されていなかった。つまり、Ps局在型メタノール代謝酵素はPex5pを介して輸送されており、Pex5pが認識するシグナル配列PTS1が異種発現タンパク質のPs輸送に最適であると結論付けた。そこで、PTS1を付与したGFPをAODプロモータにて発現させ、その細胞内局在を観察した。その結果、GFPは効率的にPsへ輸送され、Pex5欠損株ではPs輸送は観察されなかった。また、ミトコンドリアのタンパク質内膜輸送に関与するTim9の構造についても明らかにした。これらの結果は、2種のAODプロモータを利用した異種遺伝子発現系において発現タンパク質をPsに特異的に蓄積できることを示しており、P.methanolicaの新規異種遺伝子発現系を確立することができたものと考えている。

本研究项目旨在利用甲基营养酵母甲醇毕赤酵母的两个醇氧化酶（AOD）基因启动子建立新型异源基因表达系统。去年，申请人开发了一种使用两种类型的AOD基因启动子的异源基因表达系统，该系统可以使用甲醇和氧气浓度自由控制同一细胞内多种有用蛋白质的表达水平和时间。今年，我们研究了控制表达蛋白的细胞内定位的可能性。由于AOD同工酶定位于过氧化物酶体(Ps)中，因此认为可以应用AOD的细胞内转运机制来积累Ps中表达的蛋白质。因此，我们阐明了AOD同工酶细胞内运输的控制机制，并研究了表达蛋白的Ps选择性运输。首先，我们分析了 Pex5p（被认为是 AOD 同工酶的 Ps 转运蛋白）的一级结构，以及缺乏它的菌株的表型。在 Pex5 缺陷菌株中，Ps 定位的甲醇代谢酶（例如 AOD）不会被转运到 Ps。换句话说，我们得出结论，Ps定位的甲醇代谢酶是通过Pex5p转运的，并且Pex5p识别的信号序列PTS1对于异源表达蛋白的Ps转运是最佳的。因此，我们使用AOD启动子表达添加PTS1的GFP并观察其细胞内定位。结果，GFP被有效地转运至Ps，并且在Pex5缺陷株中未观察到Ps转运。我们还揭示了参与线粒体蛋白质内膜转运的 Tim9 的结构。这些结果表明，使用两种类型的AOD启动子，表达的蛋白质可以在异源基因表达系统中的Ps中特异性积累，并且表明已经建立了新的甲醇异源基因表达系统。这就是我的想法。

项目成果

期刊论文数量（0）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Peroxisomal metabolism is regulated by oxygen-recognition system through the organelle-crosstalk between mitochondria and peroxisomes.

过氧化物酶体代谢由氧识别系统通过线粒体和过氧化物酶体之间的细胞器串扰来调节。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
Yeast 24(In press)
影响因子：
0
作者：
Fujimura S;Nakagawa T;Ito T;Matsufuji Y;Miyaji T;Tomizuka N
通讯作者：
Tomizuka N

Molecular Characterization of the PEX5 gene Encoding Peroxisomal Targeting Signal 1 Receptor from the Methylotrophic Yeast Pichia methanolica.

编码来自甲基营养酵母甲醇毕赤酵母的过氧化物酶体靶向信号 1 受体的 PEX5 基因的分子特征。

DOI：
发表时间：
2007
期刊：
Yeast 24(In press)
影响因子：
0
作者：
Ito T;Fujimura S;Matsufuji Y;Miyaji T;Nakagawa T;Tomizuka N
通讯作者：
Tomizuka N

Pectin utilization by methylotrophic yeast Pichia methanolica.

甲基营养酵母甲醇毕赤酵母对果胶的利用。

DOI：
发表时间：
2005
期刊：
Microbiology 151(6)
影响因子：
0
作者：
Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.
通讯作者：
Nakagawa T et al.

Molecular characterization of the Tim9 homologue from the methylotrophic yeast Pichia methanolica.

来自甲基营养酵母甲醇毕赤酵母的 Tim9 同源物的分子特征。

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Yeast 23(9)
影响因子：
0
作者：
Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N
通讯作者：
Tomizuka N

Current Topics in Biochemistry

生物化学当前话题

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
影响因子：
0
作者：
Matsufuji Y;Nakagawa T;Ito T;Fujimura S;Chikui M;Miyaji T;Tomizuka N;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.;Nakagawa T et al.
通讯作者：
Nakagawa T et al.