新規β-ヒドロキシアスパラギン酸変換酵素の探索

寻找新型β-羟基天冬氨酸转化酶

• 批准号: 17780054
• 负责人: 和田 大
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780054/
• 关键词: ヒドロキシアスパラギン酸; PLP酵素; 新奇酵素; スクリーニング; 酵素

平成18年度はD-threo-3-ヒドロキシアスパラギン酸デヒドラターゼの探索と精製を行った。3-ヒドロキシアスパラギン酸(HO-Asp)はアスパラギン酸の構造アナログであり、4つの光学異性体を持つ。すでに4つの異性体のうちL-threo-HO-Aspに作用するデヒドラターゼがPseudomonas sp.T62から発見されている^<(1)>。本研究では、これまでに報告がないD-threo体を特異的に変換する酵素を探索し、その諸性質の解明をすることを目的とした。土壌よりD-threo-HO-Asp資化性菌を単離した。その後、TLCでD-threo-HO-Aspを減少させる速度が速い菌株を選抜し、無細胞抽出液のデヒドラターゼ活性を測定した。そのうち、最も高い分解活性を示したDelftia sp.HT23株からD-threo-HO-Aspデヒドラターゼを電気泳動的に均一に精製した。本酵素はMg2+やMn2+の金属要求性およびPLP依存性を示した。分子量はSDS-PAGE上で約41,000、ゲルろ過HPLC上で約36,000と見積もられモノマーと推定された。本酵素はD-threo体およびL-erythro体に対して高活性を示したが、L-threo体に対して微弱な活性を示した。このことから、本酵素はDL-threo-3-ヒドロキシアスパラギン酸の光学分割に利用できる可能性がある。本酵素はD-threo-HO-Aspに対して活性を示すデヒドラターゼの初めての例である。本酵素のN末端アミノ酸配列を解析した結果、本酵素のN末端はグラム陰性細菌のPutativeなアラニンラセマーゼなどと高い相同性を示した。(1)Wada M.et al., FEMS Microbiol.Lett., 179, 147-151(1999)

2006年，我们检索并纯化了D-苏型-3-羟基天冬氨酸脱水酶。 3-羟基天冬氨酸 (HO-Asp) 是天冬氨酸的结构类似物，有四种光学异构体。在四种异构体中，已经在假单胞菌属sp.T62^<(1)>中发现了作用于L-苏型-HO-Asp的脱水酶。本研究的目的是寻找一种迄今为止尚未报道的特异性转化D-苏体的酶，并阐明其特性。从土壤中分离出 D-threo-HO-Asp 同化细菌。然后，通过TLC选择以高速率还原D-threo-HO-Asp的菌株，并测量无细胞提取物的脱水酶活性。其中，D-threo-HO-Asp脱水酶从Delftia sp. HT23菌株中经电泳纯化至均质，显示出最高的降解活性。该酶表现出对 Mg2+ 和 Mn2+ 的金属需求以及对 PLP 的依赖性。在 SDS-PAGE 上估计分子量约为 41,000，在凝胶过滤 HPLC 上估计分子量约为 36,000，表明它是单体。该酶对D-苏型和L-赤型表现出高活性，但对L-苏型形式活性较弱。由此看来，该酶可能可用于 DL-苏型-3-羟基天冬氨酸的光学拆分。该酶是第一个表现出针对 D-threo-HO-Asp 活性的脱水酶。对该酶的N端氨基酸序列分析表明，该酶的N端与假定的革兰氏阴性菌丙氨酸消旋酶具有高度同源性。 (1)Wada M.et al., FEMS Microbiol.Lett., 179, 147-151(1999)