新規β-ヒドロキシアスパラギン酸変換酵素の探索

寻找新型β-羟基天冬氨酸转化酶

• 批准号: 17780054
• 负责人: 和田 大
• 金额: $ 2.3万
• 依托单位: Hokkaido University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-17780054/
• 关键词: ヒドロキシアスパラギン酸; PLP酵素; 新奇酵素; スクリーニング; 酵素

平成18年度はD-threo-3-ヒドロキシアスパラギン酸デヒドラターゼの探索と精製を行った。3-ヒドロキシアスパラギン酸(HO-Asp)はアスパラギン酸の構造アナログであり、4つの光学異性体を持つ。すでに4つの異性体のうちL-threo-HO-Aspに作用するデヒドラターゼがPseudomonas sp.T62から発見されている^<(1)>。本研究では、これまでに報告がないD-threo体を特異的に変換する酵素を探索し、その諸性質の解明をすることを目的とした。土壌よりD-threo-HO-Asp資化性菌を単離した。その後、TLCでD-threo-HO-Aspを減少させる速度が速い菌株を選抜し、無細胞抽出液のデヒドラターゼ活性を測定した。そのうち、最も高い分解活性を示したDelftia sp.HT23株からD-threo-HO-Aspデヒドラターゼを電気泳動的に均一に精製した。本酵素はMg2+やMn2+の金属要求性およびPLP依存性を示した。分子量はSDS-PAGE上で約41,000、ゲルろ過HPLC上で約36,000と見積もられモノマーと推定された。本酵素はD-threo体およびL-erythro体に対して高活性を示したが、L-threo体に対して微弱な活性を示した。このことから、本酵素はDL-threo-3-ヒドロキシアスパラギン酸の光学分割に利用できる可能性がある。本酵素はD-threo-HO-Aspに対して活性を示すデヒドラターゼの初めての例である。本酵素のN末端アミノ酸配列を解析した結果、本酵素のN末端はグラム陰性細菌のPutativeなアラニンラセマーゼなどと高い相同性を示した。(1)Wada M.et al., FEMS Microbiol.Lett., 179, 147-151(1999)

在2006年，搜索并纯化了D-Threo-3-羟基天冬酸酯脱氢酶。 3-羟基大规模酸（HO-ASP）是天冬氨酸的结构类似物，具有四个光学异构体。在四个异构体中，在假单胞菌sp。中发现了作用于l- threo-ho-asp的脱水酶。 T62。这项研究旨在探索特异性转换迄今尚未报告的D-Threo体的酶，并阐明其特性。从土壤中分离出D-threo-Ho-Ho-App-Asp-Absimilation细菌。随后，通过TLC选择了具有快速还原D-Threo-Ho-Asp的菌株，并测量了无细胞提取物的脱氢酶活性。其中，D-Threo-Ho-Asp脱水酶是从Delftia sp的。 HT23菌株，表现出最高的降解活性。该酶显示了MG2+和MN2+的金属需求和PLP依赖性。分子量在SDS-PAGE上估计约为41,000，凝胶过滤HPLC约为36,000，估计为单体。该酶显示出对D-Threo和L-errythro体的高活性，但对L-Threo体表现出微妙的活性。这表明该酶可用于DL-THREO-3-羟基大规模酸的光学分辨率。该酶是脱水酶的第一个例子，该酶表现出针对D-Threo-Ho-Asp的活性。分析了该酶的N末端氨基酸序列，该酶的N末端与革兰氏阴性细菌的假定丙氨酸种族酶具有很高的同源性。 （1）Wada M.等人，FEMS Microbiol。 Lett。，179，147-151（1999）