副腎皮質の各細胞層の機能分化に関する研究-ミネラロコルチコイド合成酵素あるいはグルココルチコイド合成酵素遺伝子の層特異的な転写因子の同定-

肾上腺皮质各细胞层功能分化的研究 - 盐皮质激素合酶或糖皮质激素合酶基因的层特异性转录因子的鉴定 -

基本信息

批准号：
05780466
负责人：
向井邦晃
金额：
$ 0.58万
依托单位：
Keio University
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for Encouragement of Young Scientists (A)
财政年份：
1993
资助国家：
日本
起止时间：
1993 至无数据
项目状态：
已结题

项目摘要

1.<ラットのグルココルチコイド合成酵素遺伝子CYP11B1のプロモーター内の調節エレメントの存在>プロモーター内の塩基配列に種々の欠失をつくり、CAT遺伝子につないで、これらの融合遺伝子を持つプラスミドを構築した。マウス副腎皮質由来のY1細胞にこれらのプラスミドを導入し、CATアッセイをおこなった。この遺伝子の転写開始点から‐314と‐252の間にプロモーター活性の正の制御配列が存在した。2.<転写開始点から‐310から‐294の位置に蛋白質の結合部位の同定>転写開始点から‐314と‐252の間の塩基配列を含むプローブとY1細胞から調整した核抽出液をインキュベートすると、ゲルシフト法によりDNAと蛋白質の複合体が生じることがわかった。DNaseIをもちいたフットプリント法により、‐310から‐294までの塩基配列が蛋白質の結合によって覆われることがわかった。この塩基配列の中央に、転写調節蛋白質としてよく知られているAP‐1蛋白質の結合配列に似たもの(AP‐1様配列)が存在した。AP‐1様配列に結合する蛋白質は、この配列に対して、AP‐1蛋白質のコンセンサス認識配列に対してよりも強く結合した。このことから、AP‐1様配列に結合する蛋白質は、既知のAP‐1蛋白質とは異なる可能性が示唆された。3.<AP‐1様配列がプロモーター内の重要な正の調節エレメントであること>AP‐1様配列の塩基配列を置換し、プロモーター活性をCATアッセイで調べたところ、活性は10分の1に減少した。以上からAP‐1様配列はプロモーター活性において、必須な配列であることが判明した。4.<ミネラロコルチコイド合成酵素遺伝子CYP11B2にはCYP11B1見いだされたAP‐1様配列が存在しないこと>ゲルシフト法で、CYP11B1のAP‐1様配列への結合蛋白質がCYP11B2のプロモーター領域に結合しないことが判明した。CYP11B1とCYP11B2は副腎皮質内の異なる細胞層に発現するからAP‐1様配列が細胞層特異的な発現調節に関与している可能性が示唆された。

1.<大鼠糖皮质激素合酶基因CYP11B1的启动子中调节元件的存在> 在启动子中的核苷酸序列中进行各种缺失，并连接至CAT基因以构建含有这些融合基因的质粒。将这些质粒导入小鼠肾上腺皮质来源的Y1细胞中，进行CAT测定。该基因转录起始位点-314至-252之间存在启动子活性正调控序列。 2.<转录起始点-310至-294位置处的蛋白质结合位点的鉴定> 将从Y1细胞制备的核提取物与包含转录起始点-314至-252之间的碱基序列的探针一起孵育，结果发现。使用凝胶迁移方法形成DNA和蛋白质的复合物。使用 DNaseI 进行足迹分析表明，从 -310 到 -294 的碱基序列被蛋白质结合覆盖。在这个碱基序列的中心，有一段与AP-1蛋白的结合序列相似的序列，它被称为转录调节蛋白（AP-1样序列）。与 AP-1 样序列结合的蛋白质与该序列的结合比与 AP-1 蛋白质的共有识别序列的结合更强。这表明与 AP-1 样序列结合的蛋白质可能与已知的 AP-1 蛋白质不同。 3. <AP-1样序列是启动子内重要的正向调控元件> 当替换AP-1样序列的核苷酸序列并通过CAT测定检查启动子活性时，活性为1/10 AP-1 样序列的值降低至由上可知，AP-1样序列是启动子活性所必需的序列。 4.<盐皮质激素合酶基因CYP11B2不包含CYP11B1中发现的AP-1样序列>使用凝胶转移法，与CYP11B1的AP-1样序列结合的蛋白质不与CYP11B2的启动子区域结合事实证明。 CYP11B1 和 CYP11B2 在肾上腺皮质内的不同细胞层中表达，表明 AP-1 样序列可能参与细胞层特异性表达调节。