高等植物ミトコンドリアゲノム形質転換系の確立

高等植物线粒体基因组转化体系的建立

基本信息

批准号：
05J12041
负责人：
藤本優
金额：
$ 1.73万
依托单位：
The University of Tokyo
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J12041/
关键词：
ミトコンドリアゲノム形質転換法

项目摘要

本年度の研究によって得られた知見を以下に記す。(1)遺伝子銃を用いたシロイヌナズナ巨大化ミトコンドリアに対する遺伝子導入処理前年度に作出に成功した巨大化ミトコンドリアを持つシロイヌナズナ成葉に対して、遺伝子銃を用いたミトコンドリアへの遺伝子導入を試みた。遺伝子導入処理には、ミトコンドリアatp6遺伝子発現調節領域によるGFP遺伝子の発現誘導を想定したベクターを用いて行った。しかし、ミトコンドリア内において導入遺伝子の発現を検出することは出来なかった。この結果を受けて、その原因の追究と技術的な改善を達成する為、以下の研究を行った。(2)巨大化ミトコンドリア内における核様体構造の解析ミトコンドリア内へ導入された遺伝子が正常に発現するためには、その核様体近傍への導入が必須の条件である。しかし、巨大化ミトコンドリア内における核様体のサイズが野生型と同程度であるとすれば、遺伝子導入に用いる金粒子のサイズとの関係上、直接的な遺伝子が導入困難であると予測される。そこで、超巨大化ミトコンドリア内の核様体サイズを検証した。Syber Green 1を用いた観察の結果、シロイヌナズナ成葉における超巨大化ミトコンドリア内の核様体は野生型と比べ、2〜3倍程度の直径を持つことが明らかとなった。しかし、細胞当りの核様体シグナルの数は減少しており、ミトコンドリア核様体への遺伝子導入の障壁となっている可能性が考えられた。(3)卵細胞ミトコンドリアを可視化したシロイヌナズナの作製高等植物の卵細胞ミトコンドリアに関して、これまでの先行研究から、その形態が巨大かつその内部に大量のDNAが包含されていることが報告されている。そこで本研究では、レーザーマイクロインジェクション法によるこの卵細胞ミトコンドリアへの直接的な遺伝子導入を目指し、まず卵細胞ミトコンドリアを特異的に可視化した形質転換シロイヌナズナ系統を作製した。ミトコンドリア内へ導入された遺伝子が正常に発現するためには、その核様体近傍への導入が必須の条件である。しかし、巨大化ミトコンドリア内における核様体のサイズが野生型と同程度であるとすれば、遺伝子導入に用いる金粒子のサイズとの関係上、直接的な遺伝子が導入困難であると予測される。そこで、超巨大化ミトコンドリア内の核様体サイズを検証した。Syber Green 1を用いた観察の結果、シロイヌナズナ成葉における超巨大化ミトコンドリア内の核様体は野生型と比べ、2〜3倍程度の直径を持つことが明らかとなった。しかし、細胞当りの核様体シグナルの数は減少しており、ミトコンドリア核様体への遺伝子導入の障壁となっている可能性が考えられた。(3)卵細胞ミトコンドリアを可視化したシロイヌナズナの作製高等植物の卵細胞ミトコンドリアに関して、これまでの先行研究から、その形態が巨大かつその内部に大量のDNAが包含されていることが報告されている。そこで本研究では、レーザーマイクロインジェクション法によるこの卵細胞ミトコンドリアへの直接的な遺伝子導入を目指し、まず卵細胞ミトコンドリアを特異的に可視化した形質転換シロイヌナズナ系統を作製した。

今年的研究结果如下。 (1)使用基因枪将基因转移到拟南芥巨型线粒体中我们尝试使用基因枪将基因导入具有巨型线粒体的拟南芥成年叶中，该线粒体已于去年成功创建。使用设计用于通过线粒体ATP6基因表达调控区诱导GFP基因表达的载体进行基因导入过程。然而，不可能检测线粒体内导入基因的表达。基于此结果，我们进行了以下研究，以查明原因并实现技术改进。 (2)巨型线粒体中的类核结构分析为了使导入线粒体的基因能够正常表达，将其导入到类核附近是必要的条件。然而，如果巨型线粒体中的核的大小与野生型相似，则由于用于基因转移的金颗粒的大小，预计直接基因转移将是困难的。因此，我们检查了超巨线粒体内的类核大小。使用Syber Green 1进行观察的结果表明，成年拟南芥叶中超增大的线粒体内的核的直径比野生型大约2至3倍。然而，每个细胞的类核信号数量减少，这可能是基因引入线粒体核的障碍。 (3)利用可视化卵细胞线粒体制作拟南芥以往的研究报道，高等植物的卵细胞线粒体巨大，内部含有大量DNA。因此，在本研究中，我们旨在利用激光显微注射将基因直接导入卵细胞线粒体，并首先创建了一个转化的拟南芥品系，其中卵细胞线粒体被特异性地可视化。为了使导入线粒体的基因能够正常表达，将其导入到类核附近是必要条件。然而，如果巨型线粒体中的核的大小与野生型相似，则由于用于基因转移的金颗粒的大小，预计直接基因转移将是困难的。因此，我们检查了超巨线粒体内的类核大小。使用Syber Green 1进行观察的结果表明，成年拟南芥叶中超增大的线粒体内的核的直径比野生型大约2至3倍。然而，每个细胞的类核信号数量减少，这可能是基因引入线粒体核的障碍。 (3)卵细胞线粒体可视化拟南芥的生产以往的研究报道高等植物的卵细胞线粒体巨大，内部含有大量的DNA。在这项研究中，我们旨在利用激光显微注射将基因直接导入卵细胞线粒体，并首先创建了一种转化的拟南芥菌株，其中卵细胞线粒体被专门可视化。

项目成果

期刊论文数量（12）

专著数量（0）

科研奖励数量（0）

会议论文数量（0）

专利数量（0）

Mitochondrial Fission Regulator, DRP3B Does Not Regulate Cell Death in Plants.

线粒体裂变调节剂 DRP3B 不调节植物细胞死亡。

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Annals of Botany (in press)
影响因子：
0
作者：
Keiko Yoshinaga;Masaru Fujimoto;Shin-ichi Arimura;Nobuhiro Tsutsumi;Hirofumi Uchimiya;Maki Kawai-Yamada
通讯作者：
Maki Kawai-Yamada

シロイヌナズナダイナミン様タンパク質DRP3AとDRP3Bのオルガネラ分裂における機能

拟南芥动力样蛋白 DRP3A 和 DRP3B 在细胞器分裂中的功能

DOI：
发表时间：
2008
期刊：
影响因子：
0
作者：
藤本優;有村慎一;中園幹生;真野昌二;近藤真紀;西村幹夫;齊藤知恵子;中野明彦;堤伸浩
通讯作者：
堤伸浩

植物細胞工学シリーズ22号「新版植物の細胞を見る実験プロトコール」1-4 共焦点レーザー顕微鏡

植物细胞工程系列第22期《新版植物细胞观察实验方案》1-4 共焦激光显微镜

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
影响因子：
0
作者：
藤本優;堤伸浩;有村慎一
通讯作者：
有村慎一

Mitochondrial Fission Regulator, DRP3B Does Not Regulate Cell Death in Plants

线粒体裂变调节剂 DRP3B 不调节植物细胞死亡

DOI：
发表时间：
2006
期刊：
Annals of Botany 97
影响因子：
0
作者：
Keiko Yoshinaga;Masaru Fujimoto;Shin-ichi Arimura;Nobuhiro Tsutsumi;Hirofumi Uchimiya;Maki Kawai- Yamada
通讯作者：
Maki Kawai- Yamada

植物細胞工学シリーズ22号「新版植物の細胞を見る実験プロトコール」1-4 共焦点レーザー顕微鏡

植物细胞工程系列第22期《新版：观察植物细胞的实验方案》1-4 共焦激光显微镜