1分子FRETによるATP合成酵素のエネルギー変換機構の解明

单分子 FRET 阐明 ATP 合成酶的能量转换机制

• 批准号: 05J08660
• 负责人: 税田 英一郎
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Tokyo Institute of Technology
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J08660/
• 关键词: FoF1-ATP合成酵素; εサブユニットによる阻害; 1分子FRET; 磁気ピンセット; εサブユニット; FoF1-ATP合成酵素; εサブユニットによる阻害; 1分子FRET; 磁気ピンセット; εサブユニット

FoF1-ATP合成酵素はFoとF1の2つの回転モーターが回転子(γεcサブユニット複合体)で連結された形をしており、回転子の回転方向を変化させることによりATPの合成/分解両方の反応を行うことができる。しかし酵素自体と基質(ATP、ADP、Pi)をすべて含めて考えたとき、これらの両方向の反応のエネルギープロファイルはまったく同じというわけではないことが近年の研究から示唆されている。つまりATP合成時とATP分解時とでは、単に回転子の回転方向が逆であるというだけでなく、εサブユニットが異なる構造をとることが知られており、この構造変化がFoF1-ATP合成酵素のエネルギー変換機構にとって重要な役割を果たしていると考えられる。そこでこの酵素1分子のATP合成/分解の活性をコントロールし、同時にεの構造変化をリアルタイムで検出する観察系を構築し、酵素の機能とεの構造状態の相関を明らかにすることを試みた。この酵素の活性のコントロールは、回転子に固定した磁気ビーズの回転を磁気ピンセットにより制御することにより行い、εの構造変化はこのサブユニットにラベルした2種の蛍光色素の蛍光共鳴エネルギー移動(FRET)を利用して検出することで行った。まず蛍光ラベルしたεサブユニットが本来の機能を有することを確認した。つぎに1分子FRET観察の光学系にビーズの回転検出光学系を組み合わせ、このことが1分子蛍光検出の感度にほとんど影響を与えないことを確認した。最後に磁気ピンセットによるビーズの回転制御系を付け加えることにより、回転子の回転検出と回転制御およびεの構造変化検出すべてを同時にリアルタイムで行うことを達成した。この観察系によりε特有の阻害の様式を明らかにした。

FOF1-ATP合酶是一种形式，其中两个旋转电动机FO和F1通过转子（γεC亚基复合物）连接，并且通过更改转子的旋转方向，可以将ATP的合成/降解均可运送出来。但是，在考虑所有酶本身和底物（ATP，ADP，PI）时，最近的研究表明，这些双向反应的能量曲线并不完全相同。换句话说，众所周知，转子的旋转方向不仅在ATP合成和ATP分解之间逆转，而且ε亚基采用了不同的结构，并且这种结构变化被认为在FOF1-ATP合酶的能量转换机制中起着重要作用。因此，我们构建了一个观察系统，该观察系统控制该酶分子的ATP合成/降解活性，并同时实时检测ε的结构变化，并试图阐明酶的功能与ε的结构状态之间的相关性。该酶的活性通过控制磁性镊子固定在转子上的磁珠的旋转来控制，并通过使用在该亚基上标记的两个荧光染料的荧光共振能传递（FRET）检测ε的结构变化。首先，已经确认标记为ε亚基具有其自身功能的荧光。接下来，将单个分子特性观测光学系统与珠旋转检测光学系统结合使用，并证实这对单分子荧光检测的灵敏度几乎没有影响。最后，通过添加一个使用磁镊子旋转珠子的控制系统，可以实时同时执行转子旋转的检测，旋转控制和ε的结构变化检测。该观察系统揭示了ε特异性抑制模式。