多胞性エンドソーム選別輸送におけるESCRT因子の機能とAlixによる制御

ESCRT 因子在多囊泡内体分选运输和 Alix 调节中的功能

• 批准号: 05J07736
• 负责人: 加藤 圭一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J07736/
• 关键词: エンドサイトーシス; ESCRT; エンドソーム; カルシウム; 細胞内小胞輸送

エンドサイトーシスによって細胞内部に取り込まれた物質は、エンドソームにおいて輸送先に応じた選別を受けることが知られている。本研究では、物質の選別過程で機能するESCRTタンパク質複合体に対し、Alix及びそのカルシウム依存的な相互作用因子であるALG-2が関与する分子メカニズムとその生理的意義の解明を目的としている。前年度の解析によってAlixおよびAlixホモログであるBroxはそれぞれのBrolドメインを介してESCRT-III構成因子であるCHMP4と直接相互作用していることを明らかにしており、さらなる相互作用解析を行った。その結果、CHMP4とBroxの相互作用は直接の相互作用であることを明らかにしたものの、酵母Two-Hybrid法及びMS解析ではその他の相互作用因子の同定は達成できなかった。Alixがエンドサイトーシスに関与することが既に判明していたため、同様にBroxもエンドサイトーシスに関与すると推測し、解析を行った。培養細胞に一過的に発現させたGFP融合Broxは様々なエンドソームマーカータンパク質とは共局在しなかったものの、アミノ末端領域欠損変異体はEGF刺激存在下においてエンドソームマーカーであるEEA1およびLamp-1と共局在することが明らかになった。このことから、Broxは細胞が特定の刺激を受けた時に、エンドソーム上に一過的に移行し、機能を果たすことが推測される。また併せて、エンドソームからの解離にはアミノ末端領域が重要な役割を担っていることが推測される。Broxはカルボキシ末端領域に脂質修飾を受けることが予測されるCAAXモチーフを持っており、他の生物種に存在するオーソログにおいても保存されていることから、細胞膜への移行にはC未の脂質修飾が必要であることが考えられた。そこで、CAAXモチーフを変異させた点変異体を作成し、培養細胞に発現させたところ、一部の変異体で膜に局在しなくなる現象が観察された。このことから、細胞膜への移行にはCAAXモチーフが重要であることが実証された。

众所周知，根据运输目的地，通过内吞作用将物质在内体中进行选择。这项研究旨在阐明ALIX及其钙依赖性相互作用因子ALG-2对在物质选择过程中起作用的ESCRT蛋白复合物的分子机制和生理意义。上一年的分析表明，ALIX和ALIX同源物BROX通过其各自的BROL域直接与ESCRT-III组成型因子CHMP4相互作用，并进行了进一步的相互作用分析。结果表明，CHMP4和BROX之间的相互作用是直接相互作用，但是通过酵母两种杂交方法和MS分析，无法实现其他相互作用因子的识别。众所周知，ALIX参与内吞作用，我们推测BROX也将参与内吞作用，并分析了它。尽管在培养的细胞中瞬时表达并未与各种内体标记蛋白共定位，但据显示，在存在EGF刺激的情况下，氨基末端区域缺陷突变体与内体标记EEA1和LAMP-1共定位。这表明BROX在内体上易位，并在细胞收到特定刺激时执行其功能。此外，据推测，氨基末端区域在与内体解离方面起着重要作用。 Brox具有一个CAAX基序，预计将在羧基末端区域进行脂质修饰，并且在其他物种中存在的直系同源物中保守，因此人们认为需要易位到细胞膜需要无C的脂质修饰。因此，当在培养细胞中产生并表达具有CAAX基序的点突变体时，观察到一些突变体不再定位于膜。这表明CAAX基序对于转移到细胞膜很重要。