多胞性エンドソーム選別輸送におけるESCRT因子の機能とAlixによる制御

ESCRT 因子在多囊泡内体分选运输和 Alix 调节中的功能

• 批准号: 05J07736
• 负责人: 加藤 圭一
• 金额: $ 1.22万
• 依托单位: Nagoya University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J07736/
• 关键词: エンドサイトーシス; ESCRT; エンドソーム; カルシウム; 細胞内小胞輸送

エンドサイトーシスによって細胞内部に取り込まれた物質は、エンドソームにおいて輸送先に応じた選別を受けることが知られている。本研究では、物質の選別過程で機能するESCRTタンパク質複合体に対し、Alix及びそのカルシウム依存的な相互作用因子であるALG-2が関与する分子メカニズムとその生理的意義の解明を目的としている。前年度の解析によってAlixおよびAlixホモログであるBroxはそれぞれのBrolドメインを介してESCRT-III構成因子であるCHMP4と直接相互作用していることを明らかにしており、さらなる相互作用解析を行った。その結果、CHMP4とBroxの相互作用は直接の相互作用であることを明らかにしたものの、酵母Two-Hybrid法及びMS解析ではその他の相互作用因子の同定は達成できなかった。Alixがエンドサイトーシスに関与することが既に判明していたため、同様にBroxもエンドサイトーシスに関与すると推測し、解析を行った。培養細胞に一過的に発現させたGFP融合Broxは様々なエンドソームマーカータンパク質とは共局在しなかったものの、アミノ末端領域欠損変異体はEGF刺激存在下においてエンドソームマーカーであるEEA1およびLamp-1と共局在することが明らかになった。このことから、Broxは細胞が特定の刺激を受けた時に、エンドソーム上に一過的に移行し、機能を果たすことが推測される。また併せて、エンドソームからの解離にはアミノ末端領域が重要な役割を担っていることが推測される。Broxはカルボキシ末端領域に脂質修飾を受けることが予測されるCAAXモチーフを持っており、他の生物種に存在するオーソログにおいても保存されていることから、細胞膜への移行にはC未の脂質修飾が必要であることが考えられた。そこで、CAAXモチーフを変異させた点変異体を作成し、培養細胞に発現させたところ、一部の変異体で膜に局在しなくなる現象が観察された。このことから、細胞膜への移行にはCAAXモチーフが重要であることが実証された。

已知通过内吞作用进入细胞的物质根据其目的地在内涵体中进行分类。在本研究中，我们旨在阐明Alix及其钙依赖性相互作用因子ALG-2参与在物质选择过程中发挥作用的ESCRT蛋白复合物的分子机制及其生理意义。去年进行的分析表明，Alix 和 Alix 同源物 Brox 通过各自的 Brol 结构域直接与 ESCRT-III 成分 CHMP4 相互作用，我们进行了进一步的相互作用分析。虽然结果表明CHMP4和Brox之间的相互作用是直接相互作用，但酵母双杂交方法和MS分析未能识别其他相互作用因素。由于已知 Alix 参与内吞作用，因此我们假设 Brox 也参与内吞作用并进行了分析。尽管在培养细胞中瞬时表达的GFP融合Brox不与各种内体标记蛋白共定位，但氨基末端区域缺陷突变体在EGF刺激存在下不与内体标记EEA1和Lamp-1共定位。共定位于这表明，当细胞接受特定刺激时，Brox 会短暂迁移到内体上并发挥其功能。此外，推测氨基末端区域在从内体解离中发挥重要作用。 Brox 在其羧基末端区域有一个 CAAX 基序，预计会进行脂质修饰，并且由于它在其他生物物种中存在的直向同源物中是保守的，因此有必要在没有 C 的情况下进行脂质修饰以转移到细胞膜。认为有必要。因此，当我们创建具有突变 CAAX 基序的点突变体并在培养细胞中表达它们时，我们观察到一些突变体不再定位于膜。这表明 CAAX 基序对于易位至细胞膜非常重要。