新規小胞輸送蛋白質STAMs・Hrsによるがん抑制機構の解析

新型囊泡转运蛋白STAMs和Hrs抑制癌症机制分析

• 批准号: 05J05019
• 负责人: 久間 昌尚
• 金额: $ 1.73万
• 依托单位: Tohoku University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for JSPS Fellows
• 财政年份: 2005
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2005 至 2007
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J05019/
• 关键词: AMSH; 脱ユビキチン化酵素; 小胞輸送; STAM; Hrs; 神経変性疾患; ノックアウトマウス; ESCRT; Dub; MVB; ubiquitin; deubiquitination

ユビキチンは標的蛋白質に結合することで蛋白分解のみならず輸送に密接に関与する。標的蛋白質のユビキチン修飾による運命決定は、ユビキチン化酵素(E3)および脱ユビキチン化酵素(DUB)の精緻なバランスにより制御されている。そのバランスの破綻は発癌にも深くかかわるとされている。我々は小胞輸送関連分子STAMに会合する機能分子探索の結果、脱ユビキチン化酵素AMSHを同定した。哺乳動物において脱ユビキチン化酵素の詳細の生理的機能や分子機構は未だ不明な点が多い。そこで我々は、AMSHの詳細な機能メカニズムと生物学的意義を解明する事を目的とし、研究を行った。作成したAMSH欠損マウスに見られる神経変性疾患様の病態がユビキチン依存的蛋白分解システムの機能不全によって発症するという仮説を立て、解析を行った。その結果、AMSH欠損マウスの脳では週令依存的にユビキチン化蛋白が蓄積しており、これらのユビキチン化タンパク質は細胞分画では不溶性・膜タンパク質分画に相当することがわかった。免疫組織染色を行ったところ、AMSH欠損マウスにおいて、脱落部位に一致したユビキチン化タンパク質の凝集像を認めた。さらに、ユビキチン化蛋白のみならず、p62、TDP-43といったヒト神経変性疾患に関連する蛋白質の蓄積を認めた。このことはAMSHが脳内において恒常的なユビキチン化タンパク質の分解を制御している可能性を示唆する。蓄積するユビキチン化タンパク質の同定が病態の解明に重要であると考え、AMSH欠損マウスの脳内ユビキチン化タンパク質の網羅的な同定を企図した。LC-MSでの網羅的な解析の前段階として、脳組織内のユビキチン化タンパク質精製法の確立を試みた。複数の調整法の比較検討の結果からGST-UBAを用いた高効率で安価なアフィニティー精製の好適条件を確立した。

通过与靶蛋白结合，泛素不仅密切参与蛋白质降解，而且还参与运输。泛素修饰对靶蛋白的命运决定是由泛素化酶 (E3) 和去泛素化酶 (DUB) 的微妙平衡控制的。据说这种平衡的破坏与癌症发生密切相关。通过寻找与囊泡转运相关分子 STAM 相关的功能分子，我们鉴定出了去泛素化酶 AMSH。哺乳动物去泛素化酶的详细生理功能和分子机制仍然很大程度上未知。因此，我们开展研究的目的是阐明AMSH的详细功能机制和生物学意义。我们假设我们创建的 AMSH 缺陷小鼠中出现的神经退行性疾病样病理是由泛素依赖性蛋白质降解系统功能障碍引起的，并对其进行了分析。结果，我们发现泛素化蛋白以年龄依赖性方式在AMSH缺陷小鼠的大脑中积累，并且这些泛素化蛋白对应于细胞部分中的不溶性/膜蛋白部分。当进行免疫组织化学染色时，在 AMSH 缺陷小鼠中观察到与脱落位点相对应的泛素化蛋白的聚集图像。此外，不仅泛素化蛋白质，而且与人类神经退行性疾病相关的蛋白质（例如p62和TDP-43）也被观察到积累。这表明 AMSH 可能调节大脑中稳态泛素化蛋白的降解。考虑到鉴定积累的泛素化蛋白对于阐明病理状况非常重要，我们的目标是全面鉴定 AMSH 缺陷小鼠大脑中的泛素化蛋白。作为使用 LC-MS 进行综合分析的第一步，我们尝试建立一种纯化脑组织中泛素化蛋白的方法。根据多种制备方法的比较研究结果，我们建立了使用 GST-UBA 进行高效且廉价的亲和纯化的合适条件。