高圧NMR法による蛋白質の広い構造空間解析に基づく構造・機能相関原理の研究

基于高压NMR方法的蛋白质宽结构空间分析的结构-功能关系原理研究

基本信息

批准号：
05J04200
负责人：
北原亮
金额：
$ 2.11万
依托单位：
The Institute of Physical and Chemical Research
依托单位国家：
日本
项目类别：
Grant-in-Aid for JSPS Fellows
财政年份：
2005
资助国家：
日本
起止时间：
2005 至 2007
项目状态：
已结题

来源：
https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-05J04200/
关键词：
圧力 NMR ダイナミクス蛋白質 protein pressure dynamics design 変性

项目摘要

本課題では、構造生物学の新しい展開として、高圧NMR法を用いて基底状態を逸脱した準安定状態の蛋白質構造研究を行った。圧力は、部分モル体積差を通して状態間の化学平衡に作用するため、一般に部分モル体積の小さな準安定構造を安定化できる。圧力を用いたNMR法は、常圧下では分布率が少なく捉えることが困難な準安定構造を高分解能で解析する優れた方法である。昨年度までに、ユビキチン構造に含まれる2つの準安定構造と、ユビキチン及びユビキチン様蛋白質(NEDD8、SUMO-2)に共通に保存された準安定構造を発見した。本年度は、Ufm1、Atg-8など他のユビキチン様蛋白質について研究展開を行なった。圧力実験に対して高い可逆性を示したユビキチン様蛋白質について解析を行うと、いずれもユビキチンに類似の準安定構造が発見された。これによりユビキチン様蛋白質に共通に保存された準安定構造の存在が確かなものになった。この準安定構造は、関連酵素との相互作用部位を含む部分で局所変性した構造をしており、分子認識機構における関連性が示唆できる。この仮説、すなわち準安定構造が高活性構造であることを示すために、異なる安定性を持つ変異体を作製し、準安定構造の分布率と活性を比較する実験を計画した。これまでに、局所変性部位に高く保存されているPro-ProをAla-Ala置換したユビキチン変異体を作製し、高圧NMR法により準安定構造の存在と分布率を決定した。

在这个项目中，作为结构生物学的新发展，我们使用高压核磁共振来研究偏离基态的亚稳态蛋白质结构。压力通过部分摩尔体积差异作用于状态之间的化学平衡，并且通常可以稳定具有小部分摩尔体积的亚稳态结构。使用压力的核磁共振方法是一种以高分辨率分析亚稳态结构的优异方法，但由于常压下分配比低而难以捕获亚稳态结构。直到去年，我们发现了泛素结构中包含的两个亚稳态结构以及泛素和泛素样蛋白（NEDD8、SUMO-2）中普遍保守的亚稳态结构。今年，我们对 Ufm1 和 Atg-8 等其他泛素样蛋白进行了研究。当对在压力实验中表现出高可逆性的类泛素蛋白进行分析时，发现它们都具有类似于泛素的亚稳态结构。这证实了类泛素蛋白中存在普遍保守的亚稳态结构。这种亚稳态结构在包含与相关酶相互作用位点的区域具有局部变性结构，表明分子识别机制中存在关系。为了证明这一假设，即亚稳态结构是一种高度活跃的结构，我们设计了一个实验，在该实验中我们创建了具有不同稳定性的突变体，并比较了亚稳态结构的分布率和活性。到目前为止，我们已经创建了泛素突变体，其中局部变性位点高度保守的 Pro-Pro 被 Ala-Ala 取代，并使用高压 NMR 确定了亚稳态结构的存在和分布率。