幹細胞システムの維持機構

干细胞系统的维持机制

基本信息

项目摘要

ICMの最初の運命決定機構を調節する分子を明らかにするため、前年度までに試験管内解析システムを利用してES細胞からExEへの分化の動態学的研究の広域な分子解析を実行した。この解析によってGATA6調節や、ExE誘導に関与している可能性のある30の候補遺伝子を確認した。今年度は、まず最初に試験管内でのスクリーニングを行い、有効な4つの候補遺伝子を選択した。同定された遺伝子はまだ完全には立証されていないが、PDGF経路に関与している可能性があり、ExE誘導はこのシグナル経路の未解明の新たな機能として考えることができる。次に、試験管内システムで確認された候補遺伝子の機能が人工的なものでないことを裏付けるため、これらを生体内で検証することを試みた。まずin-situ hybridizationによって初期発生段階のこれらの遺伝子の発現を解析し、また細胞機能をよりよく理解するためにGATA6やNanogとの発現の共局在化を探してみた。これら生体外でのアプローチと並行して、野生型桑実胚とマーキングされたKDミュータントES細胞を合わせて妊娠中の代理母マウスに移植し、ノックダウン細胞には生体内でExE系列を誘導する能力がないことを明らかにした。また同時に、生体内での発生初期段階に酷似させた受精卵にsiRNAを微量注入するという方法を用いて、生体内において遺伝子の発現を阻害してみた。この結果として、ExE欠損が確認されたことから、候補遺伝子が分化のマスター遺伝子であることが確認された。最終的にこの解析を完了するためには、絞り込んだ候補遺伝子に対する変異マウスが必要であるため、これらのマウスを作成している。
为了阐明调节ICM初始命运决定机制的分子,我们在前一年使用体外分析系统对ES细胞分化为ExE的动力学进行了广泛的分子分析。通过这一分析,我们鉴定了 30 个可能参与 GATA6 调控和 ExE 诱导的候选基因。今年,我们首先进行了体外筛选,选出了四个有效的候选基因。尽管所鉴定的基因尚未完全得到证实,但它们可能参与PDGF通路,而ExE诱导可以被认为是该信号通路的一个新的、未开发的功能。接下来,为了确认在体外系统中确认的候选基因的功能不是人为的,他们尝试在体内验证它们。首先,我们通过原位杂交分析了这些基因在早期发育阶段的表达,并寻找与 GATA6 和 Nanog 表达的共定位,以更好地了解细胞功能。与这些体外方法并行,野生型桑葚和标记的 KD 突变型 ES 细胞被移植到怀孕的代孕小鼠中,并诱导敲低细胞在体内发育出 ExE 谱系,结果显示其无能力。与此同时,他们尝试通过将微剂量的 siRNA 注射到与体内发育早期阶段非常相似的受精卵中来抑制体内基因表达。结果,确认了ExE缺陷,并且确认了候选基因是分化的主基因。为了最终完成这项分析,我们需要突变小鼠来缩小候选基因范围,因此我们正在创建这些小鼠。

项目成果

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