トリパノソーマの生命維持に必須な新規低分子膜蛋白質の機能解析

锥虫生命维持所必需的新型低分子膜蛋白的功能分析

• 批准号: 16790248
• 负责人: 中村 康男
• 金额: $ 2.24万
• 依托单位: Kurume University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2005
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790248/
• 关键词: トリパノソーマ; シグナルシークエンストラップ; dsRNAi; 膜蛋白質

前年度の結果、トリパノソーマの新規低分子膜蛋白質が蛍光抗体法により細胞膜に局在していることが予想される像が得られた。そこで、細胞膜をビオチン化し免疫沈降を用いてこの蛋白質が膜に局在していることを証明するための実験を行なった。一般的なリジンを用いたビオチン化ではこの蛋白質を免疫沈降することが出来なかった。これはC末端側にリジンが存在しないためビオチン化が起こっていないのが原因と予想される。また、C末端側にはシステインも存在しないため、カルボキシル基を利用したビオチン化を試みたが、架橋剤による凝集反応のため上手く行かなかった。現在、糖鎖を用いたビオチン化で膜蛋白であることを証明しようと試みている。また、この蛋白質に結合している蛋白質を免疫沈降で落とすことを試みた。C末端領域にFLAG、myc、HAなどの数種類のタグを付けたリコンビナント蛋白質をトリパノソーマおよびHEK293細胞に発現させたが、どれも細胞可溶化液がウエスタンブロットで反応を示さなかった。これはC末端に存在する2つのプロリンによりタグが蛋白質の内側に折り込まれマスクされてしまうことが原因であると推測される。これらに加え、昆虫型のトリパノソーマで行なっていた当教室で開発したテトラサイクリン誘導性のdsRNA発現ベクターを用いたRNAiを血流型のトリパノソーマで行なった。2種類のベクターのコンストラクトを遺伝子銃やエレクトロポレーションといった方法で導入したが、クローンを得る事が出来なかった。このことから昆虫型でも認められたようにプロモーターのリークにより少量でもRNAが抑制されるとトリパノソーマが生存出来ない事が予想される。このことよりこの低分子膜蛋白質は発現が少量ながらトリパノソーマの生存に重要な役割を果たしていると予想される。現在、siRNAを用いたRNAiを検討中である。

上一年的结果，有望通过荧光抗体方法将Tripanosoma的新的低分子膜蛋白雕像定位在细胞膜中。因此，我们进行了一项实验，以证明细胞膜是生物素，并使用免疫沉淀来证明该蛋白质位于膜中。使用一般蜥蜴的生物素无法免疫该蛋白质。这预计将是由于C末端缺乏Lidin，因此没有生物化。此外，C末端没有半胱氨酸，因此我们尝试使用羧基使用生物素，但由于交联剂的聚集反应而无法正常工作。目前，我们试图证明它是使用糖链的生物素的一种膜蛋白。他还试图通过免疫剂去除与该蛋白质的蛋白质结合。在C末端区域中具有几种类型标签的重组蛋白，在Tripanosomas和Hek293细胞中表达，但没有一个细胞溶解的溶液是蛋白质印迹。假定这是由于C末端存在的两个脯氨酸造成的，并且标签在蛋白质内折叠并掩盖。除此之外，RNAi是在血流类型的Tripano Soma中进行的，使用TETRA循环衍生物DsRNA表达载体在此教室中开发，该载体是在昆虫类型的Tripano Soma中进行的。通过基因枪和电穿孔引入了两种类型的矢量构建体，但无法获得克隆。由此，可以预期，即使启动子泄漏少量抑制了RNA，如昆虫类型中所识别的，即使RNA也无法生存。可以预期，这种低分子膜蛋白在三体瘤的存活中起着重要作用，并具有少量的表达。我们目前正在考虑使用siRNA的RNAi。

项目成果

The 14-3-3 proteins of Trypanosoma brucei function in motility, cytokinesis, and cell cycle

• DOI: 10.1074/jbc.m412336200
• 发表时间: 2005-04-08
• 期刊: JOURNAL OF BIOLOGICAL CHEMISTRY
• 影响因子: 4.8
• 作者: Inoue, M;Nakamura, Y;Fukuma, T
• 通讯作者: Fukuma, T