MGB技術を用いた造血器腫瘍における微小残存病変定量法の開発

开发利用 MGB 技术量化造血肿瘤微小残留病灶的方法

• 批准号: 16790212
• 负责人: 阿保 亜紀子
• 金额: $ 2.75万
• 依托单位: Iwate Medical University
• 依托单位国家: 日本
• 项目类别: Grant-in-Aid for Young Scientists (B)
• 财政年份: 2004
• 资助国家: 日本
• 起止时间: 2004 至 2006
• 项目状态: 已结题
• 来源: https://kaken.nii.ac.jp/grant/KAKENHI-PROJECT-16790212/
• 关键词: ALL; NHL; MRD; MGB-ASO RQ-PCR assay; 免疫受容体遺伝子; 蛍光プローブ; IgH; MGB-ASO RO-PCR assay; IgL

(目的)我々は,造血器腫瘍において免疫受容体遺伝子の多様性を利用した,allele-specific oligonucleotide rea1-time quantitative PCR(ASO RQ-PCR)法によるMRDの定量的法を開発・実践してきた.本法では,多様な免疫受容体遺伝子の共通領域にconsensusprobeを設定することで,蛍光プローブの大幅なコストダウンに成功し,検査室レベルでの臨床応用を可能にした.しかし,(1)N-reionが数塩基と短い場合には偽性が生じる,(2)NHLではプローブの。に生じたmutationのためにconsensus probeを使えない場合がある,などの欠点があった.これらの理由で解析不可能な症例は,小児ALLで10%,悪性リンパ腫で30-40%であった.そこで当該研究課題では,これらの問題を解決するために,最近開発されたMBG(minor groove binder)技術を応用したプローブ・プライマーを用いることにした.(結果)1.ALL 114例の初診時骨髄単核球からDNAを抽出し,114中74例(64.9%)でIgH遺伝子を増幅し得た,B-NHL24例の初診断時リンパ節からDNAを抽出し,24例中14例(58.3%)でIgH遺伝子を増幅し得た.クローニングシークエンスを行い,塩基配列を決定した.2.データベースより10本のMGB-VHプローブを作製した.3.ALL 24例中5例はN-regionが数塩基と短かったことから従来のVHプローブ(21-27mer)が使用できなかったが,全例でMGB-VHプローブ(16-18mer)を使用し,RQ-PCR assayが可能となった(MGB-VHプローブ可能例100%vsVHプローブ可能例79%).4.B-NHL14例中4例ではプローブの領域に生じたmutationのために従来のVHプローブが使用できなかったが,9例でMGB-VHプローブを使用しRQ-PCR assayが可能となった(MGB-VHプローブ可能例64%vsVHプローブ可能例35%).5.MGB-VHプローブを作成したALL 24中18例およびB-NHL9例について治療後Day 15,Day 35,Day 100における骨髄から単核球からDNAを抽出し,従来法のASO RQ-PCR assayおよびMGB-ASO RQ-PCR assayを用いてMRDを比較した.6.ALL, B-NHLともにASO RQ-PCR assayおよびMGB-ASO RQ-PCR assayにおけるMRD値はほぼ同等であった.7.ALLにおいてはDay 15,Day 35,Day 100におけるMRDの陽性群,陰性群では無病生存率に有意な差がみられなかった.8.ALLにおいてはDay 15のMRD残存率(Day 15 MRDコピー数/Day 0 MRDコピー数×100)が1%以上群は1%未満群に比して有意に無病生存率が低いことが示された(74.7%vs100%).(考察)MBG技術を応用したMRD定量化システムは従来法のASORQ-PCR assayが不能であった症例もRQ-PCR1 assayが可能となり,効率的な臨床応用が可能であると考えられた.ALLにおいてはDay 15におけるMRD残存率を測定することで予後を予測可能であることが示された。

（目的）我们进行了等位基因特异性寡核苷酸实时定量PCR（ASO我们开发并实施了一种使用RQ-PCR方法的MRD定量方法。在该方法中，通过在各种免疫受体基因的共同区域设置共有探针，我们成功地显着降低了荧光探针的成本。然而，（1）如果N-reion短至几个碱基，就会出现错误；（2）在NHL中，很难使用探针。存在一些缺点，例如由于肿瘤中发生突变而无法使用共识探针。因此，儿童 ALL 中无法分析的病例为 10%，恶性淋巴瘤中为 30-40%。 ，在这个研究项目中，为了解决这些问题，我们决定使用应用最近开发的MBG（小沟结合剂）技术的探针和引物（结果）1.ALL。 114例初诊时骨髓单个核细胞提取DNA，114例中74例（64.9%）有IgH基因扩增。24例B初诊时淋巴结提取DNA。 -NHL病例中，24例能够扩增IgH基因初中1。我们能够扩增 4 例 (58.3%) 的 IgH 基因，并确定碱基序列 2. 我们从数据库中创建了 10 个 MGB-VH 探针。 24 例中的 5 例无法使用常规 VH 探针（21-27mer），因为 N 区较短，只有几个碱基；然而，所有情况都使用了 MGB-VH 探针（16-18mer），并且 RQ -PCR （可使用MGB-VH探针的病例为100%，可使用VH探针的病例为79%）然而，在9例中进行了使用MGB-VH探针的RQ-PCR。检测成为可能（MGB-VH 探针可行的病例为 64%，而 VH 探针可行的病例为 35%）。5.MGB-VH 探针为 24 例 ALL 病例中的 18 例和 9 例 B-病例制备。 NHL在治疗后第15天和第35天，从第100天的骨髓单核细胞中提取DNA，并进行常规ASO RQ-PCR测定和MGB-ASO RQ-PCR。 6. ALL 和 B-NHL 的 ASO RQ-PCR 测定和 MGB-ASO RQ-PCR 测定中的 MRD 值几乎相同。 7. ALL 第 15 天和第 35 天。第100.8天MRD阳性组和阴性组的无病生存率无显着差异。在ALL中，第15天的MRD生存率（第15天MRD拷贝数/天）与小于 1% 的组相比，0 MRD 拷贝数 x 100) 为 1% 或以上的组的无病生存率显着较低（74.7% vs 100%）。（讨论）MRD 定量使用MBG技术该系统在传统ASORQ-PCR检测无法进行的情况下启用了RQ-PCR1检测，并且认为高效的临床应用将是可能的。结果表明，可以通过测量15时的MRD残留率来预测预后。

项目成果

Distinguishing between proliferating nodal lymphoid blasts in chronic myelogenous leukaemia and non-Hodgin lymphoma : A report of three cases and detection of a bcr/abl fusion signal by single cell analysis.

慢性粒细胞白血病和非霍金淋巴瘤中增殖性淋巴结淋巴母细胞的区别：三例报告以及通过单细胞分析检测 bcr/abl 融合信号。

• 发表时间: 2005
• 期刊: Pathol Int. 55
• 作者: Yashima-Abo A;Satoh T;Abo T;Aoki Y;Kowata S;Ito S;Ishida Y;Funiiwara H;Maesawa C;Masuda T.
• 通讯作者: Masuda T.

Aberrant maspin expression in gallbladder epithelium is associated with intestinal metaplasia in patients with cholelithiasis.

胆囊上皮中异常的 maspin 表达与胆石症患者的肠化生有关。

• 发表时间: 2006
• 期刊: J Clin Pathol 59(3)
• 作者: Maesawa C;Ogasawara S;Yashima-Abo A;Kimura T;Kotani K;Masuda S;Nagata Y;Iwaya T;Suzuki K;Oyake T;Akiyama Y;Kawamura H;Masuda T.
• 通讯作者: Masuda T.

Consensus JH gene probes with conjugated 3'-minor groove binder for monitoring minimal residual disease in acute lymphoblastic leukemia.

具有缀合 3-小沟结合物的共有 JH 基因探针，用于监测急性淋巴细胞白血病的微小残留病。

• 发表时间: 2005
• 期刊: J Mol Diagn 7
• 作者: Uchiyama M;Maesawa C;Yashima-Abo A;Tarusawa M;Endo M;Sugawara W;Chida S;Onodera S;Tsukushi Y;Ishida Y;Tsuchiya S;Masuda T.
• 通讯作者: Masuda T.